時間：2023-07-13 17:22:35
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇茶葉的植物學特征，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
關鍵詞：海南 植物學 熱帶特色 實驗教學
引言
植物學是生物科學及相關專業的一門重要基礎課，也是一門實踐性非常強的學科，植物學實驗是植物學教學中的一個重要環節[1-3]。從當今教學改革的發展趨勢來看，學生實踐能力的培養越來越受到重視。通過實驗，不僅能加深學生對理論知識的理解，掌握植物學研究的基本方法和基本技能，提高學生的綜合素質，培養學生的觀察、思維及創新能力。同時，可以為今后進一步應用植物學知識和技能，解決生產和科學研究中的相關問題打下良好的基礎。
海南高校生物類本科專業的植物學實驗教學除了可以發揚傳統教學內容的優點外，還可以借地處熱帶地區的優勢，積極引入海南熱帶植物材料到植物學實驗教學課堂，打造出海南熱帶特色的植物學實驗教學。
一、傳統植物學實驗教學
植物學實驗往往是生物類本科專業的第一門專業實驗課，對大一學生實驗技能、實驗素質、創新意識等的建立起著重要的作用。由于植物學實驗課程是生物類本科專業最經典的課程之一，延用幾十年的教學模式、與課程密切相配合的教學內容、約定俗成的教學習慣均是改革中需要突破的瓶頸，所以植物學實驗課程也成為教學改革的難點。
植物學理論課的教學內容和教學手段在不斷改革和發展，而實驗課教學改革滯后。海南高校的植物學實驗教學對實驗內容不斷進行調整，編排了多個綜合性實驗和設計性實驗，但整體思路和教學方式仍是以前的習慣與經驗。從植物學實驗基本技術所選用的實驗材料，到植物形態解剖實驗、植物系統分類實驗等所選用的實驗材料大部分都盡量選用實驗指導上的材料。而實驗指導書列舉的大部分植物材料是北方地區的代表植物實驗材料，選用的材料也多以北方為主[7]。這就不利于很多植物學實驗項目教學內容的開展。
二、海南高校植物學實驗教學材料分析
1.植物形態解剖實驗材料的選取
由于植物生長有明顯的地域性，有些材料還不易采到， 或因為生長環境的不同，在本地區找不到課本上的植物實驗材料。在實驗過程中適當加入海南當地的常見植物作為實驗材料。如觀察細胞后含物的油滴選用油棕果實與花生對照，觀察細胞晶體選用紫背萬年青與水鬼蕉對照。課本上的大黃（Ligularia duciformis （C. Winkl.） Hand.-Mazz.）、半夏（Pinellia ternata （Thunb.） Breit.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）等海南很難找到在課堂應用。
在植物的根系的實驗內容中，海南熱帶植物種類繁多的榕樹、熱帶蘭花的氣生根，熱帶雨林中高大喬木的板根，熱帶雨林中藤本植物的攀援根等可以為植物根系的實驗提供豐富而特別的實驗教學的素材。在植物莖的實驗中，熱帶植物的莖上生花現象，絕大多數植物都是裸芽的現象等可以作為實驗對象，并可以與課本介紹的北方植物做比較，分析各種差異的原因，鼓勵學生去探究。熱帶植物的葉片多樣，從肉質到革質，從大的幾米到小的毛狀，從復雜的構成到簡單的條狀，其多樣性令人驚嘆。
2.植物系統分類實驗材料的選取
在植物系統分類實驗中，藻類植物部分可以分為淡水藻類的觀察和海水藻類的觀察，取營養化的海水經過過濾濃縮后可以觀察到硅藻等十來種熱帶特性的藻類植物。菌類植物中海南有黑靈芝（Ganoderma atrum J.D.Zhao）、喜熱靈芝（海南當地叫竹靈芝Ganoderma calidophilum J.D.Zhao）、鹿角靈芝（Ganoderma amboinense （Lam.Fr.）Pat.）、海南靈芝（Ganoderma hainanense J.D.Zhao）、褐芝（Ganoderma bromnii （Murrill）Gilb.）[4]等在海南市場上常見。
蕨類植物和其他高等植物的野菜種類在海南有幾十種，如菜蕨（Callipteris esculenta （Retz.） J. Sm.ex Moore et Houlst.）、田字草（Marsilea quadrifolia L.）、檳榔心（Areca catechu L.）、莧菜（Amaranthus tricolor L.）、落葵（Basella alba L.）、木豆（Cajanus cajan （Linn.） Millsp.）、積雪草（海南當地叫雷公根Centella asiatica （L.） Urban）、革命菜（Crassocephalum crepidioides （Benth.） S. Moore）、閉鞘姜（Costus speciosus （Koen.） Smith）、白花地膽草（Elephantopus tomentosus L.）、刺芹（海南當地叫刺芫荽Eryngium foetidum L.）、地瓜葉（Ipomoea batatas （L.） Lam.）、芭蕉花（Musa basjoo Sieb.）、睡蓮梗（Nymphaea tetragona Georgi）、竹筍（Phyllostachys屬的多種竹子的初生、嫩肥、短壯的芽或鞭）、蔞葉（Piper betle L.）、馬齒莧（Portulaca oleracea L.）、菜（Rorippa indica （L.） Hiern.）、量天尺（海南當地叫霸王花Hylocereus undatus （Haw.） Britt. et Rose）、少花龍葵（Solanum americanum Miller）、黃鵪菜（Youngia japonica （L.） DC.）[5]等。
對常見的熱帶作物進行整理歸類，熱帶水果種類有腰果（Anacardium occidentale L.）、面包樹（Artocarpus incisa （Thunb.） L.）、番荔枝（Annona squamosa Linn.）、橄欖（Canarium album （Lour.） Raeusch.）、黃皮（Clausena lansium （Lour.） Skeels）、柚子（Citrus maxima （Burm.） Merr.）、榴蓮（Durio zibethinus Murr.）、枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）、山竹（Garcinia mangostana L.）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）、木瓜（Chaenomeles sinensis （Thouin） Koehne）、香蕉（Musa nana Lour.）、人心果（Manilkara zapota （Linn.） van Royen）、果（Mangifera indica L.）、紅毛丹（Nephelium lappaceum L.）、蓮霧（Syzygium samarangense Merr. et Perry）、百香果（Passiflora edulis Sims）、甘蔗（Saccharum officinarum Linn.）、椰子、波羅蜜等，熱帶經濟作物有劍麻（Agave sisalana Perr. ex Engelm.）、木棉（Bombax ceiba Linnaeus）、咖啡屬（Coffea Linn.）合計有五種咖啡樹、茶葉（Camellia sinensis （L.） O. Ktze.）、橡膠樹（Hevea brasiliensis （Willd. ex A. Juss.） Muell. Arg.）、苦丁茶（Ilex latifolia Thunb.）、木薯（Manihot esculenta Crantz）、可可（Theobroma cacao L.）、胡椒（Piper nigrum L.）、香莢蘭（Vanilla fragrans （Salisb.） Ames）[5]等。
把以上列舉的具有熱帶特色的常見野菜及熱帶作物種類引入植物學實驗教學課堂，引導學生去比較、分析植物的特征，將有利于促進學生對植物學基礎知識的掌握和理解。另外教師還可以帶領學生在植物學實驗教學課堂之外積極采集制作具有熱帶特征的代表性植物標本[6]，拍攝各種植物及其生態環境的圖片，應用到植物學實驗教學中，會起到事半功倍的效果。
三、結語
海南有獨特而豐富的植物資源，充分利用本地植物資源，建設具有海南熱帶特色的校園植物生態環境，建立校園熱帶作物的種植園基地。并在植物學實驗教學中把與我們生活密切相關的熱帶植物引入到植物學實驗課堂，對于加強植物學實驗教學，節省實驗經費，做到因地制宜，豐富實驗材料類型，提高學習興趣，拓寬學生思路，開闊學生視野，充分鍛煉學生獨立解決問題的能力，培養學生的創新意識等具有積極意義。
參考文獻
[1]陸時萬 徐詳生 沈敏健 植物學[M].北京：高等教育出版社，2003。
[2]周儀 植物形態解剖實驗[M].北京：北京師范大學出版社，2002。
[3]尹祖棠 種子植物實驗及實習[M].北京：北京師范大學出版社，2002。
[4]吳興亮 戴玉成 中國靈芝圖鑒[M].北京：科學出版社，2005。
[5]中國植物志電子版http：///
一
面朝云海，背倚青山，頭頂藍天，腳踏瀑布，大茶樹王屹立于天地之間。
我們一行4人，懷著朝圣的心情，踏著青苔和落葉一步步攀登，走近這棵2700年的茶樹之王。大茶樹王粗壯的莖干豎立在山坡上，樹冠部分的枝條指向蒼穹，似乎在向我們昭顯它的威嚴；樹干上綠色的苔蘚和灰白的樹皮斑駁分布，似乎在向我們講述它的滄桑。
這里是普洱市鎮沅縣九甲千家寨，在這座山頭分布著大量的野生古茶樹，一些年齡較大的古茶樹被專門編號，以利于保護，大茶樹王自然是當之無愧的“1號大茶樹”。據說約40年前，一位獵人偶然在山間發現了這棵大茶樹，消息傳出后，引起了外界的不斷重視。
1996年，由思茅政府、思茅地區茶葉學會等牽頭，召開了“哀牢山國家級自然保護區云南省鎮沅千家寨古茶樹考察論證會”。應邀參加論證會的專家，經過考察論證得出結論：“九甲千家寨古茶樹按其植物學特征，屬于野生型茶樹。根據已經掌握的有關茶樹生理生態資料和南糯山古茶樹已知樹齡（800年），結合九甲千家寨古茶樹的地理緯度、海拔高度與水熱狀況等資料綜合推算，千家寨上壩古茶樹樹齡為2700年，千家寨小吊水頭古茶樹樹齡為2500年?！?/p>
2700年前，這棵大茶樹已經在森林中伸展枝條，經歷風雨。世界目前已知的野生茶樹，年齡都小于千家寨的這棵茶樹，都是這棵茶樹的晚輩。
3540萬年前，世界屋脊青藏高原由于板塊擠壓，才剛剛從水中露頭，由海洋環境變成陸地環境，普洱地區已經孕育出未來將要潤澤萬世的珍貴物種。此后，茶樹從遠古走來，一路演化，留下一路茶花香。
在生物分類學上，古木蘭是山茶目、山茶科的祖先，是大茶樹王的祖先。茶樹演化之路延伸到千家寨的野生古茶樹，并未就此終止，而是在普洱地區先民的手中散發出更加濃郁的茶香。
從古老的寬葉木蘭，到野生茶樹、過渡型茶樹和栽培型茶樹，茶樹從遠古一步步走來，卻始終在普洱大地上繁衍生息。普洱究竟有什么神奇之處，不僅能夠孕育沁人心脾的茶香，還能千百年來凝聚這縷香氣，使其愈發濃郁呢？
二
茶是什么？誰發現了茶？誰種植了茶？誰開發了茶？誰理解了茶？誰應用了茶？茶的故鄉在哪？誰讓茶和水相遇，制造了茶杯里的江湖？
邦崴古茶樹已經超過1000歲了。1000歲的樹，并不像人類想象的那么老，比如，白發蒼蒼。如果你有機會看到它，就知道什么是綠鬢如云。聽風，沐雨，看云，朝日，拜月，然后盡一棵茶樹的本分，努力長出新芽嫩葉，開花結果。1000年的光陰，不知不覺就過去了。
世界茶樹原產地在中國，在云南，在普洱，邦崴古茶樹就是證明。
山中修煉的歲月，在1991年3月的一天被打破。思茅地區茶學理事長何仕華先生找到邦崴古茶樹，丈量了樹的身高、直徑、樹冠、分生樹干，還收集了落地的茶花、果、殼和曬青毛茶樣品。當時，邦崴古茶樹被承包給寨子里魏壯和家，魏壯和是啞巴，每年他的妻子趙云花在古茶樹身上采摘茶葉。
事實上，1984年，瀾滄縣開展茶樹品種資源普查工作，楊德興和左文忠對古茶樹做過詳細記錄：邦崴大茶樹品種為大葉綠芽茶，樹冠挺拔，枝葉茂密，生機盎然，巍然屹立在邦崴村魏四（即魏壯和）家園圃地，海拔1920米，樹高11．9米，呈喬木型，基部干徑70厘米，基部干圍224厘米。主人家在大茶樹下間種蠶豆、豌豆耕挖管理，每年采摘茶葉十多斤，自家飲用。這棵茶樹的茶特別好吃，回味爽口，清香，茶湯濃。邦崴大茶樹，是瀾滄縣老茶區中栽培型最大的一株。
在邦崴古茶樹被山外的人們認識以前100多年間，國際學術界根據印度阿薩姆存活的古茶樹，傾向于認為茶葉原產地在印度?？脊艑W專家黃桂樞先生認為布朗族先民濮人是邦崴古茶樹的歷史主人。華南農業大學學者李斌先生認為：邦崴古茶樹是較云南大葉種和印度阿姆種更原始、起源更早的茶樹，是野生型向栽培型過渡的類型。
對于過往，古茶樹笑而不語。
三
“你們看這兩棵古茶樹，一棵大葉種，另一棵葉片要小得多，生長在一起?！?/p>
李興昌師傅手指兩棵高大的茶樹，向我們講述著他的古茶園，以及他對茶樹和茶葉的理解。
這里是困鹿山古茶園，天下聞名的困鹿山貢茶就產于此地。李師傅家世代種茶、制茶為生，從最早遷入此地的祖上算到李師傅這一代，已經有8代人了。李師傅提到自己家族的一個細節，那就是不論遷到什么地方，住處旁邊都有古茶樹。也許祖上在遷徙的過程中，就隨身攜帶著安身立命的根本——茶樹種子或茶樹苗。
當然，我妄自揣測，李師傅祖上隨身攜帶的最重要的東西，還不是這些身外之物，而是他們的傳統種茶技藝，以及對種茶、制茶技藝的追求和敏感性。
根據李師傅的經驗，一般海拔1600米到2000米的山坡地帶的茶葉質量較好，而在困鹿山地區，古茶園海拔在1700米到1800米，屬于最優的茶樹生長環境。由于困鹿山茶葉品質好，很早就被當地官員當做饋贈禮品，贈來贈去，就上貢到了皇帝那里，于是困鹿山的茶園成了皇家茶園。在清代，每到采摘茶葉的季節，政府都會派兵把守，先將上貢皇家的茶葉采足備齊后，才允許當地茶農進來采摘。
貢茶制作工藝一代代傳承下來，在李師傅這里繼續發揚光大。簡略地說，傳統的制作工藝流程首先要祭祀茶神，然后是原料采選、萎凋、殺青、搓揉、晾曬、壓制成型，最后形成了成品。
坐在古茶園中的木棚子里，我們一邊喝著用原始的方式加工的烤茶，一邊繼續聆聽李師傅的“茶經”。我問起他對茶的價值的看法，他說，首先茶是有味道的，這是茶被人飲用的最重要原因；其次，喝酒容易醉，喝茶卻不會，茶在人的社會交往中起到了很好的作用。至于那些外界宣傳的普洱茶治病、防病等神奇功效，李師傅有意無意地淡化。
茶性本潔，以李興昌師傅一家為代表的普洱古茶園的茶農，在漫長的種茶、制茶、吃茶的生產生活中，也浸染了茶中那大道至簡的本性，他們的人性因為接觸茶性而變得平和、潔凈。
然而，市面上的有些茶書來歷各異，甚至還涉嫌抄襲，諸多觀點或異或同，或與實際相差甚大。對茶業危害最大的是脫離實際的技術性觀點，因而有必要將這類書籍及觀點昭示于商家和消費者。
近期出版的某部普洱茶書，是集中上述諸多問題的書籍典型。
區別茶樹品種，太過膚淺
該書說：臺地茶與古樹茶的區別是古樹茶“一般比較粗老，芽頭少，多會有茶?！?，而臺地茶則“細而緊結。芽頭多”。實際這只是表象。不是本質區別，所以“有用臺地茶粗老葉仿制的茶餅”和“老樹茶一芽二葉制作的條索緊結芽頭多的茶餅”。這兩類毛茶條索區別不是芽頭多少和條索的粗老與細嫩，而是葉片薄厚、色澤、毛度、葉韌度等不同。泡過的新茶葉底。老樹茶深綠色或深黃綠色，低齡樹茶淺白或淺黃色。陳化老樹茶與低齡樹茶應綜合上述因素以及顏色變深褐色或淺褐色等來分辨。
該書講：老樹茶與低齡樹茶毛料氣味的區別是“老樹茶香要比小樹的更深沉和強烈。差別明顯”。但是六大茶山倚邦、易武丁家寨等地小喬木茶香度比許多異地老樹茶高。這兩類毛茶香氣區別是老樹茶帶有特殊的酸氣味。此味越濃，其料越純。這兩類茶滋味區別，澀度不是主要因素，還要看茶尖老嫩度、各片區茶味共性并綜合甘甜濃厚度等來分辨。這在筆者《老樹茶的分離與分辨》中作過闡述。
信口雌黃，污蔑普洱茶
該書說：“普洱茶是不發酵茶。發酵說的誤導使普洱茶不能越沉越香”、“自然干燥保存的老茶香氣散失嚴重”、“已經有較好沉香的老樹茶出倉后不加以密封香氣會很快散失”、“密封保存的老樹茶”“3年后茶香入茶湯”、“普洱茶不能透氣儲存”。必須“封閉儲存”、普洱茶不是“越陳越香”。而是“越沉越香”，即“沉積下來之香”。把茶的氣味因混雜而不顯香誤解成“散失香氣”。
公認的生物化學理論認定：“廣義的發酵是指利用生物體（包括微生物、植物細胞、酵母菌等）的代謝功能，使有機物分解的生物化學反應過程?！笨梢?，普洱茶的發酵屬“廣義的發酵”。
眾所周知。正常普洱新茶湯多顯橘黃色。其湯內未溶入茶紅素。在適當環境透氣保存6年的該茶，湯色明顯發紅。這證明其湯內已溶入茶紅素，該茶細胞或其成份已有分解現象。按上述“發酵的廣義概念”，該茶已經發酵了，可是該茶仍散發純正濃郁的陳舊芳香。憑何說：普洱茶“透氣保存”而發酵就“幾乎都是越存越不香”呢？普洱茶的儲存可以非真空封閉，但不等于“必須”封閉。
該書說“越陳越香”是偶然“巧合”，那么眾人透氣儲存的近十年的眾多茶餅，隨意抽泡。為何都散發出撲鼻誘人的陳香呢？
除部分茶區古樹茶外，多數普洱茶都偏苦澀，須妥善存放六至十年以上，苦澀度降低才飲用。既然其苦澀度降低，證明其細胞或成份發生分解。按上述“發酵的廣義概念”，該茶發酵了，但它們仍能發出濃郁陳香！可見該書中的謬論是對普洱茶的歪曲和污蔑！
此人所存茶“幾乎都是越存越不香”的原因：或存放不當；或儲存被人存壞的二三手茶；或收藏了劣質茶；或收藏了以不適合料（偏北或偏南茶）制作或假冒的普洱茶。
混淆歪曲多個概念
該書說：“一般而言，老樹茶強于小樹茶：喬木茶強于臺地茶；有森林環境的老樹茶強于無森林環境的老樹茶；緯度低的靠南的茶強于緯度靠北的茶；海拔適度（1400米～1800米）的茶強于海拔過高過低的茶；大葉種茶強于小葉種茶”。但六大茶山多數小喬木茶甚至臺地茶的正常存香優于許多地帶的老樹茶；六大茶山多數生態矮化茶儲香優于許多地帶喬木茶；無森林的數百年樹齡老樹茶儲香優于有森林的百年老樹茶；緯度約11°15’以南或22°20’以北的儲香不如緯度11°15’～22°20’之間的茶；海拔1100米～1400米的六大茶山茶的儲香優于眾多海拔1400米～1800米的它山之茶；倚邦小葉茶的儲香優于許多異地大葉茶。
該書對“灌木茶”與“喬木茶”、“臺地茶”與“古樹茶”、“古樹喬木茶”與“矮化茶”、“臺地茶”與“喬木茶”、“生態茶”與“非生態茶”等概念與區別含混不清。老樹茶與嫩樹茶的區別，最初是從同片區這兩類茶的苦澀度上發現的，兩者的分離。也是由此引發的。同片區近百年或上百年樹齡的茶的苦澀度明顯比七八十年及其以下樹齡的茶清淡。因而它們是以百年左右樹齡為界線的。“古樹茶”就是老樹茶，包括矮化灌木茶和喬木型兩類。但前者并非臺地茶。
喬木茶和灌木茶的區分，在古六大茶山也是從茶味澀度和厚度上引起的。它有兩個本質標準：一是指植物學所指的喬木型和人為重度矮化型（包括老樹類和嫩樹類）；二是按根系類型化分的有主根的喬木型和僅有須根的扦插類，即有性繁植苗和無性繁苗兩類。前者只要不被矮化，可長成高大喬木；后者即使不被矮化也無法長成高大古喬木，其茶澀度偏高而茶味偏薄，故列為灌木茶。
臺地茶通常是低齡、矮化、密植的茶，包括無性系苗種的梯式茶林和密植而被重度矮化的有性系梯式茶林。
對于喬木茶與臺地茶的分辨，該書說：喬木茶與臺地茶。需從喬木茶的分布與產地、山野氣韻、喬木茶特征、廠家與價位、干茶特征、試泡、葉底、手感、芽頭、葉底香氣、杯底香等方面綜合分辨。但這樣“品鑒”是極不可靠的。知道喬木茶的分布與產地，卻存在原料交叉流動；論“山野氣韻”，天然生態林的矮化茶也會有；若看廠家，彼地廠家會收購和制作此地茶；若看價位，更會隨產主定價信譽度而千變萬化；說是按“喬木茶特征”或“干茶特征”分辨，卻沒介紹兩者的特征及本質區別；若看耐泡度、品茶湯苦澀度、回甘度及濃厚度，則嫩樹喬木茶的耐泡度也偏低，回甘也偏弱，濃厚度也偏薄，而且不同地域同類茶的耐泡度、苦澀度、回甘度及濃厚度有別；若看葉底顏色深淺，則背陰地的臺地茶尤其是重度矮化的老樹茶也有似喬木茶那樣偏深的；試手感的柔韌度，則只能分辨百年老樹茶與低齡樹茶，但喬木茶未必是老樹茶。低齡喬木茶也有柔韌度較差的；若看芽頭多少和粗老度，喬木茶和臺地茶都有芽頭多的和細嫩的，也都有芽頭少的和粗老的；若嗅葉底香和杯底香，則不與天然雜木混生的喬木茶也缺乏植物香型。所以其所介紹的品鑒方法繁雜無效，還明顯誤導。實際上，矮化臺地茶受重度修剪。抽芽較快，韌性偏差，沖泡后頂部嫩梗嫩葉受搓揉易成腐化狀；露天暴曬。葉底毛層薄而光澤亮度低。多數色澤淺黃；又與雜草混生，氣味幾乎不帶花香型。葉邊齒更細密短淺，多呈傾斜狀。這些概念代表的是不同的茶質及價格。該作者信口開河歪曲這些概念，將坑害茶商及消費者。
“存儲研究”，漏洞百出
該書的“存儲研究”是漏洞百出的“作秀”幌子。請看該書“沉香例證”所列6例（受篇幅限制從略）及對6例的列表“研究”。
由此6例得出：
（1）濕度過大的廣東自然存茶香味散失比較快目嚴重；
（2）云南自然存放香味散失比廣東慢；
（3）相對密封的干燥的存儲茶香保持得好；
（4）已經有較好沉香的老樹茶出倉后不加以密封香氣會很快散失；
（5）自然干燥保存的老茶香氣散失嚴重；
（6）密封保存的老樹茶香氣保存好，而IEI 3年后茶香入茶湯。
其“研究”邏輯漏洞是：
對1～4例茶的初制、復制和前期保存作者不清楚。原料來源？可適合長期存放？毛茶初制工藝如何？前期存放是否有誤？這些因素都會影響其儲香。多個變因下研究未知問題，憑何判定普洱茶不適合自然存放？第1、2、4例都曾存在濕度大的場所，難免受潮；第3例“有少許霉點”表明也受潮發霉。未必“昆明自然存放”。若嚴重受潮甚至發霉，固然不香，但自然透氣存放未必就會受潮和發霉，也就未必非要“封閉儲存”；第4例“失香”原因未必是透氣，還可能是該茶存香時限已過，況且還受開封后環境影響？第5例并未透露“自然”和“未密封”使茶香“散失”的信息，反而證明普洱茶適合干燥自然存放，且適宜發酵；第6例似表明“密封保存香氣好”的結論。就算這樣，部分古樹茶以外的普洱茶苦澀度普遍偏高。密封保存，很難讓它的苦澀味隨時間推移逐漸降低。既然如此，我們存放該茶，除了備用，還有何意義？更何況表中第2、3行的“微香”和“有香”無明顯區別，即使有實質性差別，填寫未必屬實。因為普洱茶有限期間“越陳越香”，是指隨時間的延長，茶香由新鮮逐漸轉為陳舊。并不是越閉住散出的香氣，“沉積”的香氣越多，茶品就越香。好茶的香氣是內存并不斷散出，沖泡時集中散出來，不是靠“沉積”下來的。依靠密封留住的香氣，一旦解封就散盡，根本無法讓它“沉積”到茶品內。適合長期珍藏的茶，在存香期內因保存不當不顯香，不是“茶香散失”。而是氣味混雜。“失香”是直接沒了氣味，這與正常存放的保質期有關，與存放方式無關。茶香早在新茶時就“入湯”，只是那時香氣新鮮，“3年后”其香型變“陳舊性”罷了，并非“3年后茶香入茶湯”。
后話
關鍵詞：臺茶12號（C. sinensis ‘Taicha 12’）；福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）；花粉；離體萌發；生活力；貯藏力
中圖分類號：S571.1；Q944.42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6067-05
茶樹[Camellia sinensis （L.）O.Kuntze]是多年生異花授粉的木本植物，因其葉含有多種對人體有益的功能成分，而被作為一種經濟作物廣泛栽培。生產上茶樹多采用無性繁殖以保持其優良性狀，卻易導致品種退化和病蟲害抗性降低[1]。雜交育種是培育茶樹新品種的重要途徑之一。但茶樹為異花授粉的蟲媒花植物，且開花期間氣溫低、昆蟲活動少，導致茶樹天然結實率較低[2]。在育種實踐中，往往由于茶樹親本的花期不遇給雜交育種工作造成很大困難。茶樹花粉的生活力與貯藏力研究為解決這些問題提供了一條思路，對茶樹雜交育種以及種質資源保存具有一定的理論與實踐意義[3，4]。目前，關于茶樹花粉生活力和貯藏力的研究報道較少[4-8]。鑒于此，以華中農業大學校內種植的兩個茶樹品種為試材，開展花粉生活力與貯藏力研究，以期為茶樹雜交育種與優良種質保存提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
以華中農業大學茶園引種栽培的的兩個品種為試材。臺茶12號（C. sinensis ‘Taicha 12’）：由臺灣省茶葉改良場選育，無性系，灌木型，中葉類，中生種[1，2]。福鼎大白茶（C. sinensis ‘Fuding-dabaicha’）：由福建省福鼎市點頭鎮柏柳村選育，無性系，小喬木型，中葉類，早生種[1，2]。
1.2 方法
1.2.1 花粉采集及貯藏 于2010年12月盛花期間天氣晴好的上午，采集生長良好的福鼎大白茶、臺茶12號的大蕾期花朵。攤放于白紙上，并置于陰涼通風干燥處放置24 h使花蕾開放、花藥開裂。用毛筆輕輕刷下花粉，并置于陰涼通風干燥處，至抖動花粉不結塊時收集。取少許新鮮花粉用于篩選適宜萌發的培養基以及檢測花粉生活力試驗。剩余花粉分別裝入離心管中，以脫脂棉封口，置于干燥器中，花粉體積不超過離心管體積的1/3。將干燥器分別置于室溫（RT）、4、-20、-70 ℃下避光貯藏。
1.2.2 花粉生活力檢測 采用人工離體萌發法檢測花粉生活力，具體試驗方法及步驟如下。
1）花粉的吸水處理。播種前，取新鮮花粉于4 ℃、暗環境、飽和空氣濕度條件下放置2 h，以充分吸水[9]。
2）培養基中各因素對花粉離體萌發的影響。茶樹喜酸性土壤，以臺茶12號為試材，分別設置瓊脂濃度、pH、蔗糖、H3BO3四因素各三個水平，進行正交試驗（表1），以初步確定各因素對花粉離體萌發的影響。播種時，用解剖針將充分吸水的花粉均勻播種于培養基，并將培養基置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，蓋上培養皿，于25 ℃暗培養24 h后觀察花粉萌況[10]。每個培養皿于10×10顯微鏡下觀察，每個視野不少于50?；ǚ?，記錄每個視野的發芽率（萌發花粉數/花粉總數），以花粉管長度大于花粉直徑時記為萌發。取6個視野的平均值作為該培養基的花粉發芽率，初步確定花粉離體培養時各因素適宜的水平。
3）兩種花粉最適離體萌發培養基的篩選。為了篩選兩種花粉最適離體萌發培養基，在上述試驗的基礎上，設置10種固體培養基，pH 5.4，基本成分為1.0% 瓊脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2 + 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，設置3種添加量的蔗糖（5%、10%、15%）和3種濃度的H3BO3（50、100、200 mg/L）進行完全組合，以不添加蔗糖和H3BO3的基本培養基為對照（表2）。
4）萌發溫度對花粉離體萌發的影響。茶樹于冬季低溫期開花。以臺茶12號新鮮花粉為試材，對萌發溫度、培養基瓊脂含量與pH對花粉離體萌發的影響進行了研究。將花粉吸水后播種于最適培養基上，分別置于4 ℃、室溫（16～21 ℃）、28 ℃、37 ℃下進行暗培養，培養8、24 h后進行花粉生活力測定。
1.2.3 貯藏期間花粉生活力的測定 以福鼎大白茶和臺茶12號花粉為試材，取出4種溫度下貯藏0、7、15、30、60、120、180 d的花粉，置于4 ℃下吸水2 h后播種于上述試驗篩選的最適離體萌發培養基，進行生活力測定，以此確定兩種供試花粉的貯藏力。
1.2.4 數據分析 方差分析、多重比較采用SAS 8.1統計軟件分析。所有百分數都進行反正弦轉換后再用于數據分析。
2 結果與分析
2.1 培養條件對茶樹花粉離體萌發的影響
2.1.1 培養基各因素對臺茶12號花粉離體萌發的影響 從表1和表2可以看出，瓊脂、pH、蔗糖、H3BO3 4個因素均對臺茶12號花粉的萌發產生了明顯的影響，各因素對茶樹花粉離體發芽率的影響從大到小為 pH、H3BO3、瓊脂、蔗糖。pH的影響最為明顯，因此，合適的pH對花粉離體培養成功與否至關重要。1.0%的瓊脂更有利于花粉的離體萌發。隨著H3BO3和蔗糖添加量的增多，花粉發芽率總體呈現先升高后降低的趨勢，說明低于和高于最適宜的H3BO3和蔗糖濃度均會對花粉萌發產生一定的抑制作用。根據以上結果，篩選出最適宜臺茶12號萌發的培養基組合為：1.0%瓊脂+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2+200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3，pH 5.4。
2.1.2 最適離體培養基的篩選 由表2可以看出，H3BO3、蔗糖及其交互作用對兩種茶樹花粉的發芽率均有明顯影響。添加蔗糖和H3BO3后，兩種花粉的發芽率均明顯高于對照。當蔗糖添加量一定時，花粉發芽率隨H3BO3濃度增加呈不同的變化趨勢；當H3BO3濃度一定時，花粉發芽率也隨蔗糖添加量的增加呈不同的變化趨勢。可見，適宜濃度的蔗糖、H3BO3對供試茶樹花粉離體萌發有明顯的促進作用。在培養基S2B2上，福鼎大白茶和臺茶12號的花粉發芽率均達到了最大值，分別為54.09%和64.02%，明顯高于其他培養基上的發芽率。可見，培養基S2B2適合茶樹花粉離體萌發。此外，對各種培養基上福鼎大白茶與臺茶12號的花粉發芽率進行比較，兩種茶樹花粉發芽率差異明顯，說明茶樹花粉發芽率存在種間差異。
綜上所述，供試培養基中，最適宜的福鼎大白茶和臺茶12號花粉離體萌發的培養基組成均為：基本成分+10%蔗糖+100 mg/L H3BO3，這與正交試驗結果一致，說明正交試驗結果較為可靠。
2.1.3 培養溫度對茶樹花粉萌發的影響 從表3可以看出，臺茶12號花粉在 4～37 ℃均可萌發?；ǚ叟囵B8 h后，4 ℃、室溫（16～ 21℃）、28 ℃、37 ℃下的花粉發芽率差異顯著。其中室溫條件下花粉發芽率最高，為37.56%，其次為28 ℃和4 ℃，37 ℃條件下花粉發芽率最低，為11.70%。
隨著培養時間的延長，各溫度條件下的花粉發芽率均有所增加。其中，37 ℃下花粉發芽率始終最小，培養24 h發芽率為14.03%，說明高溫不適宜茶樹花粉的離體萌發。4 ℃下的花粉發芽率增長最快，培養24 h后發芽率已超過室溫和28 ℃，增至最大，達到45.46%。多重比較結果顯示，培養24 h時4 ℃與室溫、28 ℃下的花粉發芽率差異顯著。由此可見，4～21 ℃下茶樹花粉都可以充分萌發，但以低溫下萌況較好，可能跟臺茶12號于冬季低溫期開花、授粉的習性具有一定的關系。
2.2 貯藏時間和溫度對茶樹花粉生活力的影響
2.2.1 貯藏時間對花粉發芽率的影響 隨著貯藏時間的延長，各貯藏溫度下福鼎大白茶、臺茶12號花粉的生活力總體呈逐漸降低的趨勢，即貯藏時間越長花粉發芽率越低。對福鼎大白茶而言，整個貯藏期內，不同溫度下貯藏花粉的發芽率呈現很大的差異，但是在貯藏前60 d內，僅有小幅度降低，仍均保持在40%以上。多重比較結果表明，此時不同溫度之間的發芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏時間里，各貯藏溫度之間的發芽率開始呈現顯著差異。其中室溫下發芽率急劇降低，至180 d時，花粉已完全失活；4℃下貯藏60 d后也開始大幅度下降，至180 d時發芽率僅有20.45%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整個貯藏期間花粉發芽率僅有小幅度下降，至180 d時發芽率仍分別有46.88%和50.61%（圖1）。
對于臺茶12號而言，不同溫度下貯藏花粉的發芽率降幅亦呈現很大的差異，但是在貯藏前30 d內降幅均較小，發芽率仍均保持在60%以上。多重比較結果顯示，此時不同溫度之間的發芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏期間，各貯藏溫度之間的發芽率開始呈現顯著差異。其中室溫下貯藏30 d后花粉發芽率開始大幅下降，至180 d時花粉已完全失活；4 ℃下貯藏120 d后開始大幅度下降，至180 d時發芽率僅有18.79%；而在-20 ℃和-70 ℃下，在整個貯藏期間花粉發芽率僅有小幅度下降，至180 d時發芽率仍分別有60.16%和71.12%（圖2）。
綜上所述，隨著貯藏時間的延長，福鼎大白茶和臺茶12號花粉活力均呈現下降的趨勢。但是通過采取降低貯藏溫度的措施可有效延長花粉貯藏期，保持花粉活力在較高水平，同時也說明兩種供試花粉有長期貯藏的潛能。
2.2.2 貯藏溫度對花粉發芽率的影響 從圖1和圖2 可以看出，在相同的貯藏期內，貯藏溫度越低越有利于茶樹花粉活力的保持；貯藏時期越長，貯藏溫度越低越有利于花粉活力的保持。對于福鼎大白茶，短期貯藏（60 d以內）時，4種貯藏溫度之間的發芽率差異不顯著，因此可采用4 ℃或者-20 ℃進行花粉貯藏，簡便易行。在長期貯藏中（180 d）-20 ℃和-70 ℃效果最好，二者之間發芽率差異不顯著，因此亦可采用-20 ℃進行貯藏，以節約成本。對于臺茶12號，短期貯藏（30 d內）各貯藏溫度之間的發芽率差異不顯著，于室溫、4 ℃和-20 ℃下貯藏均可；貯藏120 d內，4 ℃、-20℃和-70 ℃之間差異不顯著，因此，采用4 ℃和-20 ℃下貯藏即可；貯藏180 d時，以-70 ℃貯藏的效果最好，且-20 ℃和-70 ℃之間差異不顯著，因此采用-20 ℃下貯藏亦可較大程度保持花粉的活力。
2.2.3 不同貯藏溫度下花粉顏色的變化 貯藏期間兩種供試花粉的顏色均呈現由金黃色、明亮黃色、明亮淡黃色灰白色不同程度的變化（圖3）。其中，金黃色、明亮的茶樹花粉發芽率高，活力強，隨著顏色變暗，其活力也逐漸降低。當顏色呈灰白色、光澤偏暗時，生活力即喪失。同一品種花粉在不同溫度條件下貯藏180 d后顏色變化差異較大，貯藏溫度越低，顏色保持得越鮮亮，花粉發芽率越高；而貯藏溫度越高，顏色逐漸呈現灰白色，無光澤，花粉發芽率越低，甚至喪失活力。說明茶樹花粉顏色變化與其活力變化具有一定的相關性。因此，在生產實踐中，可根據貯藏花粉的色澤來初步判斷花粉活力的有無，大大簡化了花粉活力檢測手段，提高了工作效率。
3 小結與討論
花粉是種子植物的雄配子體，在有性繁殖中發揮著重要作用。而對新鮮花粉和貯存期間的花粉生活力進行檢測，則可以掌握花粉的形態及生理特征，評估花粉是否有受精能力等[11]。目前，可用于檢測新鮮花粉及貯藏期間花粉生活力的方法有多種[12]，其中花粉離體萌發法因簡便快捷，直觀可靠，花粉發芽率被認為是評估花粉活力的最佳指標[13]，因此，花粉離體萌發法不僅成為最常用的花粉生活力檢測手段，也是分析有性繁殖基本問題的主要思路[14]。
3.1 影響茶樹花粉生活力的因素
在離體培養的各因素中，H3BO3及蔗糖的濃度對花粉離體萌發影響較大[15]，適量的蔗糖和H3BO3有利于花粉的萌發[10，16]。試驗中不同蔗糖、H3BO3添加量對茶樹花粉萌發有明顯的影響，且H3BO3與蔗糖之間存在明顯的交互作用。兩種茶樹花粉萌發的最佳蔗糖、H3BO3添加量均為10%、100 mg/L；適量的蔗糖與H3BO3明顯促進了茶樹花粉的萌發。
其次，培養溫度、pH、瓊脂含量都對花粉離體萌發具有一定的影響。極端培養環境如高溫和高濕脅迫，不僅使花粉萌發受到抑制，而且花粉形態也有可能發生改變[13，17]。本研究中，4 ℃和室溫（16～21℃）下較適宜茶樹花粉的離體萌發，花粉形態和花粉管生長均正常。而在37 ℃下，花粉呈褐色，部分花粉干癟開裂。此外，在28 ℃和37 ℃下培養的茶樹花粉，其花粉管長度明顯短于其他溫度下的，說明高溫不利于茶樹花粉管伸長，這可能與茶樹盛花期間氣溫低、日溫差大等環境因素具有一定的相關性。
3.2 花粉離體萌發的通用培養基
試驗篩選的最適培養基組合（1.0%瓊脂 + 300 mg/L Ca（NO3）2+ 200 mg/L MgSO4 +100 mg/L KNO3 +10% 蔗糖+100 mg/L H3BO3）與Brewbaker等[18]報道的適合39科79屬86種植物花粉萌發的培養基組合基本一致。說明該培養基適合于多數植物的花粉生活力檢測，可作為植物花粉離體萌發的通用培養基。在對某種植物首次進行花粉生活力測定時，可先采用該培養基進行探索，從而簡化了培養基篩選過程，加快了試驗進度，保留了新鮮花粉的活力，保證了試驗的可靠性。
3.3 溫度對茶樹花粉貯藏的影響
花粉活力保持時間由基因型決定[19]，同時植物花粉小，貯藏的營養物質有限，而其呼吸作用又比較強烈。因此，花粉生活力會因高強度呼吸導致花粉養分消耗過度而降低[20]。而貯藏前對花粉進行干燥處理降低花粉含水量，貯藏時選取低溫、低O2含量、避光等條件將使花粉細胞內部各種代謝活動減緩，在相同時間內即可減少花粉有機物質消耗，利于延長花粉的壽命[21]。已有研究證實溫濕度對茶樹花粉貯藏影響較大[4-7]，本研究探討了4種溫度下貯藏兩種供試花粉的活力變化。
貯藏溫度對兩個茶樹品種的花粉生活力保持具有顯著影響，且品種間受貯藏溫度的影響也存在差異。溫度越低越有利于花粉活力的保持，室溫條件下，花粉貯藏120 d生活力即降低至50%以下，180 d后即完全失活。4 ℃可應用于兩種花粉的短期貯藏（60 d內），貯藏60 d時，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為65.60%、45.14%，這為解決茶樹育種授粉時花期不遇提供了較為簡單的解決方案。-70 ℃最適于茶樹花粉的長期貯藏（180 d）；貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為71.12%、50.61%；而-20 ℃貯藏180 d后，臺茶12號、福鼎大白茶的花粉發芽率分別為60.16%、46.88%，仍具有一定的雜交可行性，可用于雜交育種工作的開展。因此，可根據實際的貯藏條件和貯藏所需天數制定兩種供試花粉的貯藏方案，巧妙安排，合理利用。由于時間限制，本研究僅進行了180 d，展現了不同貯藏溫度下兩種供試花粉的活力變化趨勢，可以滿足當季雜交工作的開展，但仍有必要探討貯藏360 d時花粉活力的保持情況。此外，貯藏后的花粉能否完成受精作用尚需進一步試驗探討。
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關鍵詞:山藥(Dioscorea batatas Decne);內生菌;抑菌活性;分離;篩選
中圖分類號:S432.4+2文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)10-2318-04
Isolation and Screening of Endophytes with Inhibition Activity
from Chinese Yam Rhizomes
ZHAO Long-fei
(College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)
Abstract: A total of 34 endophytes were isolated from different parts of Chinese yam rhizomes by grinding method and spread plate method. Inhibition activity against pathogens and its biological characteristics were analyzed. The results showed that four strains preliminarily screened had obvious inhibition to Bacillus subtilis, with inhibition rates of above 24%. Strain HNSQSY04 had the maximum inhibition rate of 52%. One strain had inhibition activity to Escherichia coli. Gram staining, spore staining, growth curve of four strains screened were analyzed. Results showed that HNSQSY14, HNSQSY24, and HNSQSY31 had Bacillus genus features. HNSQSY04 had the features of the genus Gracilibacillus.
Key words: yam rhizome; endophyte; inhibition activity; isolation; screening
基金項目:國家自然科學基金項目(31204301);河南省高校青年骨干教師資助項目(2012GGJS166); 河南省科技廳科技攻關項目(112102110177);河南省教育廳科學技術研究重點項目(12A210019)
植物內生菌（Endophyte）是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物各種組織內部或細胞間隙，而不使宿主產生明顯病理癥狀的微生物［1］。植物是內生菌的宿主并給內生菌提供營養，內生菌則產生具有一定生物活性的次生代謝產物，如植物生長調節劑、抑菌劑、殺蟲物質、抗病毒成分等［2］，與植物形成共生互利關系，產生一定的生物防治和穩定生態環境的作用［3］。將植物內生菌作為生物防治菌不僅可避免因使用化學農藥給環境帶來的污染，還可避免殺死非靶標微生物和破壞植物根際土壤的微生態平衡，在防治植物病害方面有較大的應用潛力，成為國內外微生物研究的熱點之一［3-5］。
山藥（Dioscorea batatas Decne）為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）多年生草質藤本植物薯蕷的塊根，是中國傳統的藥食同源植物。它含有豐富的DHEA、蛋白質、糖類、黏液質、皂苷、維生素、膽堿、淀粉酶、糖蛋白、氨基酸、多酚氧化酶等成分。一些研究對山藥的內生細菌和真菌進行了分離和篩選［2，6-8］，但鮮見對河南山藥病原菌拮抗性內生菌系統研究的報道。本研究以河南山藥為試驗材料，篩選對細菌具拮抗作用的內生菌，并進行微生物學鑒定，以獲取其基本信息，為山藥拮抗菌的利用提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1山藥惠樓山藥,來自于河南省商丘市虞城惠店集鄉樓村(砂壤土);鐵棍山藥,來自河南省焦作市溫縣(黏土)。
1.1.2試劑草酸銨結晶紫、盧戈氏碘液、番紅、次氯酸鈉、無水乙醇、孔雀石綠等。
1.1.3培養基 LB固體培養基:NaCl 10 g,酵母膏5 g,蛋白胨10 g,瓊脂10 g,補水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌 20 min [9]。液體培養基不加瓊脂。
牛肉膏蛋白胨液體培養基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,補水至1 000 mL,pH 7.2~7.4,121 ℃滅菌20 min[9]。固體培養基另加瓊脂10 g。
高氏1號培養基:可溶性淀粉20 g,KNO3 1.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO4?3H2O 0.5 g, MgSO4?7H2O 0.5 g,FeSO4?7H2O 0.01 g,瓊脂20 g,補水至1 000 mL,pH 7.4~7.6,121 ℃滅菌30 min[9]。
1.2方法
1.2.1材料的表面消毒分別取山藥的底部、中部、上部,先用無菌水沖洗2~3次;把山藥放入75%乙醇中30 s,迅速取出再放入5%的次氯酸鈉中3~8 min,然后用無菌水沖洗5~8次。最后一次沖洗過各部位的水用移液槍分別吸取500 μL涂平板,檢測表面消毒是否徹底。
1.2.2內生菌的分離、純化和保藏經表面消毒的山藥組織2 g放入無菌研缽中,研磨至黏稠漿狀[6],向研缽中加入18 mL無菌水,攪拌均勻,即制成10-1的菌懸液。取不同部位的山藥研磨液,分別稀釋成10-2、10-3、10-4 3個梯度。分別取山藥不同部位研磨液的稀釋液500 μL涂布平板,3個重復。置入恒溫恒濕培養箱中30 ℃倒置培養,觀察、記錄結果。挑取單菌落,以劃線分離法接種到培養基上28 ℃倒置培養24 h后鏡檢觀察。重復操作,直至獲得純菌株。
1.2.3拮抗菌的篩選和鑒定
1)病原菌的活化。大腸桿菌(Escherichia coli CGMCC1.1103)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis CGMCC1.769),為商丘師范學院生命科學學院微生物學教研室保藏。
將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌以平板劃線法轉接到牛肉膏蛋白胨培養基上,置于培養箱中28 ℃倒置培養,活化后分別轉接到牛肉膏蛋白胨斜面上,待斜面長飽滿后暫時保藏于4 ℃冰箱備用。
2)拮抗菌篩選。采用濾紙片法[10]篩選對病原菌有抑制作用的內生菌。制備大腸桿菌菌懸液,用移液槍吸取200 μL涂布牛肉膏蛋白胨平板。在平板上均勻放置4個直徑1.00 cm的圓形濾紙片,在濾紙片上加10 μL內生菌懸液,以滴加10 μL無菌水的作為空白對照,30 ℃恒溫倒置培養?？莶菅挎邨U菌的操作方法同大腸桿菌。觀察并記錄試驗結果,選取具有抑菌效果的菌株復篩。復篩以相同方法進行,培養72 h后測抑菌圈直徑(含濾紙片),每株菌3個重復。
3)抑菌效果的計算。病原細菌抑菌效果用抑制率衡量,抑制率=(處理抑菌圈直徑-濾紙片直徑) /濾紙片直徑×100%[11]。
4)拮抗菌株形態學鑒定。參照參考文獻[9],對內生菌分別進行革蘭氏染色、芽孢染色、菌體形態和大小等的測定。
5)拮抗菌的生長特征。把篩選出的內生細菌接種到滅菌的LB液體培養基中,恒溫振蕩培養箱28 ℃ 130 r/min培養,每隔2 h取樣一次,持續44 h。在波長為600 nm處測光密度。以光密度值(OD600 nm)為縱坐標、對應的培養時間(h)為橫坐標繪制生長曲線。
2結果與分析
2.1內生菌的分離情況
鐵棍山藥和惠樓山藥的不同部位共分離34株菌株,根據菌落特征初步判斷其32株為細菌,2株為放線菌。
2.2拮抗菌的篩選和鑒定情況
對山藥中分離的34株菌株進行抑菌篩選試驗(圖1、圖2),篩選出4株拮抗菌株,其抑菌情況見表1。
從表1可見, HNSQSY04、HNSQSY14、HNSQSY24、HNSQSY31對枯草桿菌都有抑制作用,抑制率均在24%以上,其中HNSQSY04的抑制率最大,達52%。HNSQSY31對大腸桿菌表現出抑制作用且效果不明顯,抑制率僅為12%,其他3株對大腸桿菌沒有抑制作用。
2.3菌株形態學鑒定情況
菌株形態學鑒定結果見表2、表3、圖3。由表2、表3可知,拮抗菌分別分離自惠樓山藥的底部、上部以及鐵棍山藥的中部。篩選出的4株菌株的顏色不一致,菌落都較為濕潤、易挑取;菌株HNSQSY04和HNSQSY31來自惠樓山藥,菌落較小,邊緣不規則,且菌落較薄,革蘭氏染色分別呈紫色、紅色,細胞都呈桿狀,且前者有芽孢(圖3);HNSQSY14和HNSQSY24來自鐵棍山藥,菌落較大,邊緣規則,呈乳白色和淺棕色,革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌,無芽孢。
2.4拮抗菌的生長特征
拮抗菌的生長特征見圖4。菌株HNSQSY04和HNSQSY24的潛伏期較短,4 h開始進入對數生長期,可見這2株的適應能力均較強,但后者的對數生長期較短,培養9 h已進入穩定期;而HNSQSY14和HNSQSY31在培養8 h后進入對數生長,14 h后進入穩定期,約31 h后,4株菌株可能因產生的次生代謝產物或營養匱乏開始進入衰亡期。
根據菌株的菌落特征,革蘭氏染色、芽孢染色和菌體形態、大小特征,根據參考文獻[12,13]進行鑒定,HNSQSY04符合芽孢桿菌屬特征,HNSQSY14、HNSQSY24和HNSQSY31均有桿菌的特征。
3小結與討論
1)以山藥為材料,在從山藥中分離出的34株菌株中發現有4株對枯草芽孢桿菌有抑菌作用,占總菌數的11.76%,抑菌率均在24%以上,其中菌株HNSQSY04對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最為明顯,抑菌率達52%。而對大腸桿菌僅有1株有抑制作用。說明來自同一種宿主的內生菌對不同病原菌有不同的抑菌活性。但是內生菌在活體上對病原菌的抑制能力是否和體外一致,還需進一步的驗證。
2)植物內生菌與寄主植物經長期的協同進化,形成互相依賴、和諧共處的關系,寄主植物為內生菌提供生境和生長發育所需的營養,植物體內有些內生菌對病原物具有拮抗作用或誘導寄主植物產生抗性,從而提高寄主植物的抗病性[14],能控制作物病害的內生菌是一種潛在而豐富的生防資源。內生菌在植物體內長期進化,可能擁有部分與宿主相同的基因,也可產生與宿主相同或相似的活性成分[15],宿主可為進行內生菌代謝產生活性成分的機理研究提供材料。
3)本試驗從鐵棍山藥和惠樓山藥中分離得到的內生菌株都屬于桿菌,但具體的種屬劃分還需對內生菌進行生化試驗、16S rDNA序列測定等進一步研究。這些菌株能否增加山藥的抗病性,能否對除試驗所用病原菌以外的病原菌有抑菌作用,還需進一步研究。
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關鍵詞： 草莓； 指紋圖譜； 分子標記； SSR
中圖分類號：S668．4 文獻標識碼：A 文章編號：1009－9980?穴2011?雪06－1032－06
Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry (Fragaria ananassa) native to Europe and America
WANG Zhuang-wei，ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji，WU Wei-min， QIAN Ya-ming
（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014 China）
Abstract: The total DNA of 38 strawberry cultivars originating in Europe and America ，such as Earliglow， Induka， Darselect ，Senga， Litessa， were amplified by 44 pairs of SSR primers. The PCR products were separated in 8% polyacrylamide sequencing gels. Some factors which affected amplified products，such as dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and so on were also studied. Optimum condition was as follows：25 μL PCR reaction system consisted of 1×PCR Buffer， 2.5 mmol?L-1 MgCl2， 0.4 μmol primer， 0.2 mmol dNTP， 1.5 U Taq polymerase and 60 ng DNA. The amplification conditions were 94 ℃ for 1 min，35 cycles of 94 ℃ for 30 s，annealing temperature for 30 s ，72 ℃ for 30 s and a final extension step at 72 ℃ for 7 min． Ten pairs of primers which could amplify stable and distinct band were selected. The electrophoresis results of the 38 strawberry DNA samples were evaluated and analyzed. Eventually， 29 cultivars could be distinguished by the fingerprint map constructed by only 4 pairs of SSR primers．
Key words: Strawberry； Fingerprinting； Molecular marker； SSR
草莓在世界上廣泛種植，是重要的經濟果樹。全世界草莓屬約20個種，2 000多個品種。草莓通過匍匐莖營養繁殖，容易造成種質資源圃或育苗地品種混雜。長期以來，人們主要根據形態特征來鑒定區分草莓品種。草莓育種往往集中利用少數優良親本，遺傳基礎狹窄，栽培草莓多為八倍體，眾多農藝性狀為數量性狀，且草莓的植物學性狀易受環境、栽培、氣候等影響，傳統的形態學方法常常難以區分相近的草莓品種[1-2]，品種的純度及品種權保護需要可靠的種質鑒定方法。
近年來，分子生物學技術發展迅速，它具有快捷、簡便的特點，極大彌補了傳統方法的缺陷，日益成為品種注冊登記、品種權保護和解決種苗糾紛的重要依據，涉及到RFLP、RAPD、AFLP及SSR等不同類型的標記[3-6]。RFLP技術多態性表現穩定，但需經酶切、DNA分子雜交、放射自顯影等過程，步驟繁瑣而費時，而且在草莓種間特別是與栽培品種關系最密切的多倍體種間RFLP多態性很低[7]。RAPD具有快速、簡便、多態性豐富的特點，因而已成為至今草莓上研究應用最多的分子標記。但RAPD-PCR技術對試驗條件控制要求較高，標記穩定性較差，重復性欠佳，且在八倍體草莓中擴增還存在劑量效應，擴增帶的出現與該位點在基因型中的拷貝數有關，給實際應用帶來一定困難[2，8]。AFLP多態性豐富可以很好地區分鑒定草莓品種，但AFLP技術對DNA提取質量要求很嚴格，在草莓不同生長階段或者不同組織提取的DNA難以獲得重復性結果[9]。且八倍體栽培草莓品種多為雜合體，而RAPD和AFLP都非共顯性標記，難以檢測位點的純合與雜合[2]。
SSR標記，是一類由幾個核苷酸（一般為2~5 bp）為重復單位組成的簡單串聯重復序列，其重復次數在物種間、品種間甚至個體間具有非常大的變異性，很多作物的研究表明，SSR標記分布于整個基因組，具有數量豐富，等位變異高，共顯性，檢測簡單，結果穩定可靠等優點，得到了廣泛應用[10-11]。多倍體草莓中顯性標記呈現劑量效應，SSR穩定性好且呈共顯性遺傳，作為草莓分子標記技術方法更為理想[2]。近年來草莓SSR引物數據不斷增加，得到廣泛的研究應用。
近年來，國外科研工作者開發了大量的草莓SSR引物，并已應用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建等方面[1，12-13]。但國內還未見草莓SSR分子標記的研究報道，指紋圖譜構建的研究也很少。我們以栽培品種為試材，建立了草莓SSR-PCR反應體系，并利用SSR標記建立了草莓38個歐美品種指紋圖譜數據庫，以期為鑒定品種，保證品種的真實性和純度，維護生產者和育種家的利益奠定基礎，并為進行草莓種質的指紋圖譜鑒定和數據管理提供依據。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供試品種加拿大、因都卡、達賽萊克特、森加拉等38個歐美草莓種質均取自江蘇省農業科學院國家果樹種質南京桃草莓圃（表1）。
1.1.2 試劑及設備 TaqDNA聚合酶、dNTP等購于MBI Fermentas公司， 常規試劑均為分析純。PCR反應在德國生產的Biometra T1上進行，離心機使用BACKMAN X-22R。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 參考陳大明等[14]方法，略作修改，提取草莓葉片基因組DNA并進行DNA樣品的濃度和純度的測定，將DNA樣品稀釋至10 mg?L-1備用。
1.2.2 引物合成 根據參考文獻[15-16]，選擇了來自草莓屬的44對SSR引物，由英駿生命技術有限公司合成（表2）。
1.2.3 SSR-PCR擴增 （1）PCR反應體系。為獲得穩定可靠的試驗結果，在25 μL反應體系中對各個成分進行優化，以期最終確定PCR的最佳反應體系。（2）PCR反應程序。 94 ℃預變性1 min；94 ℃ 30 s，Ta 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環；最后72 ℃延伸7 min，擴增產物4 ℃保存待電泳檢測。
1.2.4 PCR產物的檢測 采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，電泳后銀染染色。 1.2.5 引物篩選及指紋圖譜的構建 利用白燈箱觀察電泳結果，進行數據統計并拍照。從44對引物中篩選出條帶清晰、擴增結果穩定的引物對品種進行試驗，根據組合鑒別結果確定核心引物構建指紋圖譜。
2 結果與分析
2.1 草莓SSR反應體系的建立
由圖1可知，dNTP濃度從0.15～0.4 mmol?L-1 5個濃度梯度中均得到相同擴增產物，但相比之下，當dNTP用量為0.2 mmol?L-1 時，可以得到理想的擴增效果，因此，確定dNTP適宜用量為0.2 mmol?L-1 ；隨著引物濃度的增加，擴增條帶亮度增加，濃度為0.2 mmol?L-1 時，條帶很弱，濃度為0.5 mmol?L-1 時可能是引物過量引起引物與模板非特異性配對增加，濃度在0.3～0.4 mmol?L-1 時，擴增結果條帶清晰，基本一致，確定引物適宜用量為0.4 mmol?L-1 ；隨著Mg2+濃度的增加，擴增條帶逐漸加深，當Mg2+濃度為3.0 mmol?L-1 時，擴增的特異性降低，條帶產生彌散現象。選用條帶最清晰2.5 mmol?L-1 為適宜濃度。由圖2可知，當Taq酶濃度在0.5～1.5 U時，擴增帶清晰一致，濃度為2.0、2.5 U時，擴增帶有彌散現象，背景模糊，不易觀察，故選用1.5 U為適宜濃度。DNA濃度為10、20 ng時，擴增帶較淺；濃度為80 ng時，擴增帶彌散不清；濃度為40、60 ng時條帶清晰，60 ng的條帶最為清晰，故確定60 ng為最佳濃度。最終確定25 μL PCR的反應體系中各成分為： 1×Buffer；2.5 mmol?L-1 MgCl2；0.4 μmol?L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol?L-1 dNTP；60 ng DNA。
2.2 SSR引物的篩選
利用44對SSR引物，對10個隨機試驗樣本進行SSR-PCR擴增分析。44對SSR引物擴增結果的多態性水平有較大差異，條帶數最少為3條，最多的達到19條，片段大小為93～298 bp。從中篩選了擴增帶型穩定、多態性豐富、重復性較好、帶型清晰的P7、 P16、 P18、 P19、 P20、 P22 、P26 、P33、 P34、 P35 10對引物（表3），對38份草莓品種正式進行SSR-PCR擴增分析。
2.3 DNA指紋圖譜的構建
從10對引物的擴增結果看，10對引物都能將38份品種區分為幾個類型，但單一引物都無法區分所有品種。6、15與27；11與35；13與25；26與31；10對引物擴增結果的帶型都相同，無法相互區分開來。根據10對引物擴增的組合鑒別結果，最終確定了P18、P22、P33 、P35 4對SSR引物為本研究的核心引物，進行DNA指紋圖譜的構建。
根據引物P18的擴增結果，品種2、14、16、17、23、30、37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種1、3、6、15、18、27、28、32、34、38帶型相同，品種8、9、10、19、24帶型相同，品種12、22帶型相同，品種4、21、33帶型相同，品種5、20帶型相同，品種7、29帶型相同，品種11、35、36帶型相同，13、25帶型相同，品種26、31帶型相同（圖3）。
根據引物P22的擴增結果，品種17具有特異性帶，可以與其他品種區分開，品種2、5、11、16、35帶型相同，4、8、12、19、22、23、32帶型相同，13、25帶型相同，9、24、33帶型相同，10、36帶型相同，1、3、6、7、14、15、18、20、21、26、27、28、29、30、31、34、37、38帶型相同（圖4）。
根據引物P33的擴增結果，品種37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種2、3帶型相同，品種1、4、6、8、13、15、19、22、23、24、25、27、30、32、33帶型相同，品種7、9、16、18、20、29、34、36帶型相同，品種5、10、11、12、14、21、26、31、35、38帶型相同，品種17、28帶型相同（圖5）。
根據引物P35的擴增結果，1、2、7、12、34、37具有特異性帶型，可以與其他品種區分開，品種3、4、5、9、13、14、16、17、18、19、20、21、23、24、25、33、36帶型相同，品種6、15、22、27、28帶型相同，品種8、10、11、26、29、30、31、32、35、38帶型相同（圖6）。
由4個核心引物擴增條帶的組合鑒別結果看，6、15與27為一類；11與35為一類；13與25為一類；26與31為一類；其他29個品種都可以根據4個引物的擴增結果相互區分開來，建立有效的指紋圖譜。
3 討 論
從研究SSR-PCR體系的優化過程可知SSR對反應條件要求不嚴格，各反應成分均具有較大的適宜范圍，大多數都能擴增出穩定清晰的帶型；在體系優化、引物最初篩選、指紋構建3個過程中，同一引物擴增結果一致，表明SSR標記結果穩定、重復性高。SSR分子標記操作過程經濟實用，簡單便捷，準確可靠，對試驗要求不高。國際植物新品種保護聯盟（UPOV）已將SSR標記技術和單核苷酸多態性技術（SNP）推薦為適合構建指紋圖譜數據庫的兩種技術，認為SSR標記技術是目前最為成熟的技術[17]。
RAPD、AFLP、SSR等分子標記手段在國外已成功地用于指紋圖譜和品種鑒別[18-20]，我國草莓分子標記方面的研究起步較晚，研究報道不多，主要是利用RAPD和AFLP技術手段進行親緣關系分析或雜種的鑒定[21-23]，草莓SSR分子標記及指紋圖譜構建研究很少。本研究應用SSR技術，初步構建了草莓基因組DNA指紋圖譜構建的技術體系，最終利用4對SSR引物能完全區分親緣關系較近的29個歐美品種，為草莓DNA指紋圖譜的構建奠定了基礎。SSR標記技術還可以利用多個引物進行多重PCR擴增，這將可以大大節省時間和成本，該技術在國外已有成功報道[1]，本單位將進一步優化建立多重SSR標記技術。
本研究中的歐美草莓品種材料采自國家草莓種質資源圃，最初來源都是國內各單位從國外引入，在草莓引種過程中，由于引種單位不同，或引種地區不同，或最初引種記錄不詳等原因，造成一些品種名稱、來源等資料不詳或不準確，存在同物異名和同名異物的情況。在本研究中，維斯托爾、S1和里瓦；加拿大四季和波波拉特卡；加拿大和MSU4359；早光和B2；用篩選的條帶清晰多態性好的10對引物都未能區分開來，該結果有可能是因為親緣關系很近難以區分，亦有可能是因為引種過程中造成的同物異名，這還需篩選更多的SSR引物進一步擴增驗證，或結合其他分子標記手段，并根據植株形態特征來進一步驗證。
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