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開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇云計算的基本種類，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
關鍵詞：瀘西；園林；植物多樣性；應用現狀；調查
中圖分類號：S688文獻標識碼：A文章編號：16749944（2014）10012103
1引言
園林植物是城市生態系統的重要組成部分，在凈化空氣、調節氣候、美化景觀等方面具有重要的作用。住房與城鄉建設部把“編制城市建成區植物物種多樣性規劃”列入園林城市評選標準。在西方經濟發達國家，城市綠地植物多樣性水平已經成為城市生態環境建設的一個重要標志。
2調查地概況
瀘西縣位于云南東南部，紅河州北部，地處紅河、文山、昆明、曲靖四州市交匯處，與貴州省的黔西南州遙遙相望，處于滇中經濟圈的節點上，是昆明的“后花園”、紅河州的“北大門”。東北面與師宗縣接界，東南面與丘北縣相望，西南面與彌勒市毗鄰，西北面與路南、陸良縣相連。縣城中樞鎮居縣境中部，海拔1710m，距昆明市206km。
縣域土壤以紅壤為主，屬半濕潤常綠闊葉林的分布區域，受巖溶缺水地貌影響，植被以次生植被石山灌木林和灌叢為主。年均氣溫15.2℃，極端最高氣溫34.1℃，最低氣溫-7℃，年均日照2122h，年均降雨量979mm，無霜期272.7d[1]。
3調查方法
調查采取實地踏查的方式，于2012年9月至2013年5月對城市建成區內五大綠地進行調查，統計各綠地單元植物種類、生長狀況等數據。
4結果與分析
4.1種類及數量
經實地調查，目前瀘西縣城市綠地共應用園林植物98科243屬368種。喬灌草藤竹比例為15∶13∶10∶2∶1，常綠落葉之比為6.5∶3.5。
按進化順序分，蕨類植物1科1屬1種，約占總數的0.27%；裸子植物8科17屬31種，約占總數的8.42%；被子植物89科225屬336種，約占總數的91.30%。
按生長習性分，喬木種類134種，約占總種數的36.41%，其中常綠植物為81種，落葉植物為53種，常綠落葉比約為1.53：1；灌木種類117種，約占總種數的31.79%，其中常綠植物為84種，落葉植物為33種，常綠落葉比約為2.55：1；草本種類90種，約占總種數的29.17%，其中多年生草本較多，一二年生較少；藤本種類18種，其中常綠藤本為10種，落葉藤本為8種，常綠落葉比約為1.25：1，約占總種數的4.89 %，竹類9種，約占總數的2.45%。
4.2區系組成
4.2.1科的分析
在縣城建成區應用的園林植物98科中，應用最多的為薔薇科，達到27種，占植物總種類的27.84%；其次為桑科、禾本科、木蘭科、柏科、百合科、木樨科、蝶形花科、棕櫚科、天南星科和五加科，應用種類在10種以上；而樟科、菊科、含羞草科、蘇木科、馬鞭草科、紫葳科、松科、石蒜科、美人蕉科、夾竹桃科、大戟科、鳶尾科、楊柳科、杉科、忍冬科、槭樹科、葡萄科、錦葵科、蕓香科、桃金娘科、鼠李科、柿樹科、山茶科、莎草科、茄科、黃楊科、海桐花科、杜鵑花科、冬青科、百合科、芭蕉科、紫茉莉科、小檗科、無患子科、衛矛科、蘇鐵科、睡蓮科、山茱萸科、茜草科、千屈菜科、漆樹科、牛兒苗科、楝科、金縷梅科、葫蘆科等45個科應用種類在2種到9種；酢漿草科、醉魚草科、澤瀉科、榆科、銀杏科、楊梅科、鴨跖草科、旋花科、繡球花科、菜科、香蒲科、仙人掌科、西番蓮科、梧桐科、商陸科、山龍眼科、山柑科、南洋杉科、毛茛科、馬錢科、馬齒莧科、羅漢松科、龍血樹科、藜科、肋果茶科、藍果樹科、蠟梅科、殼斗科、姜科、胡桃科、厚殼樹科、紅豆杉科、旱金蓮科、珙桐科、鳳仙花科、杜仲科、杜英科、唇形科、檉柳科、安石榴科、腎蕨科等41科應用種類僅為1種。
4.2.2屬的分析
在科下屬的等級中，應用最多的為榕屬（桑科），達16種；其次為含笑屬（木蘭科）、女貞屬（木樨科）、梅屬（薔薇科）、扁柏屬（柏科）、圓柏屬（柏科）、木蘭屬（木蘭科）、樟屬（樟科）、沿階草屬（百合科）、美人蕉屬（美人蕉科）、鵝掌柴屬（五加科），應用種類都達4種以上；而銀杏屬（銀杏科）等多達184個屬的植物都僅應用了1種。
在屬的等級中，包含種數在3種及以上的共有26屬，對這26屬根據吳征鎰院士的中國種子植物分布區類型進行劃分[2，3]，一定程度上能代表瀘西縣城市園林植物的區系分布總體狀況。其中熱帶區系屬15屬，占總屬數的57.69%，溫帶區系屬11屬，占總屬數的42.31%，熱帶成分與溫帶成分之比約為6∶4。由此可知，瀘西縣城市園林植物具有較大優勢的熱帶區系成分，能較好地符合該區北回歸線以北的位置和典型的北亞熱帶季風氣候特征，也能較好地體現本區植物區系由溫帶向熱帶過渡的性質。
4.3應用廣泛性及生長狀況分析
通過對建成區范圍內的103個基本綠地單元進行實地調查，統計同種植物在所有基本綠地單元中出現的次數，得出該種植物在建成區內基本綠地單元的使用頻度。經統計，建成區使用較為廣泛的樹種有86種（使用頻度6.80%以上），其中喬木為37種，灌木為34種，草本18種，藤本3種，竹類1種。
4.3.1喬木
應用最廣泛的37種喬木中，小葉榕應用最為廣泛，38.83%的綠地都有應用；桂花、陰香、加那利海棗、女貞、雪松、滇樸、猴樟、南洋杉、枇杷、紫薇、白蘭、杜英、干香柏、廣玉蘭、龍柏、香樟、銀杏、大絲葵、復羽葉欒樹、黃連木、清香木、日本櫻花應用也較為廣泛，應用頻度都超過了10%；冬櫻花、柳杉、雅榕、圓柏、白玉蘭、木蓮、云南櫻花、側柏、垂枝槐、二喬玉蘭、高榕、紅花羊蹄甲、樂昌含笑、球花石楠應用頻度也超過了6.80%。
4.3.2灌木
在應用最廣泛的40種灌木中，金葉假連翹、紅花木和光葉子花應用頻度最高也最為突出，都達到40%以上；其次為鵝掌柴、蘇鐵、萼距花、紅葉石楠、錦繡杜鵑、南天竹、金竹等7種，應用頻度都在20%以上；再次為灰莉、雙莢決明、石榴、金葉女貞、月季、八角金盤、海桐、雞爪槭、小蠟、江邊刺葵、大葉黃楊、華東山茶、毛桃、米仔蘭、小葉女貞、金錢榕、楊梅、圓葉榕、紫葉李、垂花懸鈴花、垂絲海棠、鳳尾絲蘭、龜甲冬青、花孝順竹、雀舌黃楊、紫竹、含笑、花椒、黃金榕、灑金千頭柏。
4.3.3草本
應用最為廣泛的草本植物為腎蕨，其次為銀邊沿階草、春羽、吊蘭和美人蕉。
4.3.4藤本
藤本中應用最為廣泛的是常春藤和三葉地錦，占有絕對優勢，其次為炮仗花和常春油麻藤，其余較少。
4.4主要綠地斑塊物種多樣性
公園綠地中，植物種類最多的為文化中心綠地，達到113種，其次為阿廬公園、濱河綠地和鐘秀公園，分別達到93種、58種和53種。各公園綠地植物造景較能體現地方特色，管理較為規范，造景較為細膩，特別是廣場綠地配有民族、地域元素的雕塑和小品，整體效果較好，但各綠地植物搭配也或多或少存在較為同質化的缺點。
道路綠地中，植物種類最多的是瀘發大街和迎賓路，其次是阿廬大街，植物種類分別為17種、17種和13種。
單位附屬綠地中，應用植物種類超過20種的有12個，超過40種的有住建局和瀘西一中，分別為47種和46種。新建單位一般養護管理基本到位，少數單位綠化管養不夠規范，導致草坪退化嚴重，植物生長稍顯凌亂。
居住區附屬綠地以近年來新建居住區綠地率最高，應用植物種類最多，效果也最好，從側面也說明政府和民眾越來越重視居住環境的營造，生態建設越來越深入人心。
在居住區綠地建設中，應用植物最多的是明珠花園，其次為金橋寨、陽光花園、錦繡園、建馨苑，應用植物種類分別為70種、57種、56種和56種，大部分新建小區物種較為豐富，景觀優美，養護到位。
2014年10月綠色科技第10期
宋 鼎，等：瀘西縣城市綠地植物多樣性調查研究園林與景觀
4.5觀賞特性分析
4.5.1觀花植物
瀘西縣城應用的觀花喬木有138種，主要喬木有紅花木蓮、白蘭、醉香含笑、云南擬單性木蘭、冬櫻花、云南櫻花、黑荊、滇合歡、頭狀四照花等；灌木包括萼距花、石榴、華東茶、光葉子花、八仙花、馬纓丹等；藤本包括多花素馨、藤本月季、金銀花；草本包括萬壽菊、孔雀草、萱草、美人蕉、蜘蛛蘭等，以薔薇科和木蘭科植物為最多。
總之，由于該地氣候適宜、植物搭配等因素，瀘西縣建成區園林植物基本能做到四季有花，但以春花植物最多，其它季節開花植物相對較少。
4.5.2觀果植物
在調查中發現，瀘西縣園林綠化所應用的觀果植物也相對較多，光喬木種類就有73種，分別為銀杏、雪松、華山松、羅漢松、云南紅豆杉、望春玉蘭、山玉蘭、白玉蘭、廣玉蘭、大果木蓮、紅花木蓮、白蘭、醉香含笑、深山含笑、峨眉含笑、云南含笑、黃蘭、樂昌含笑、紫葉小檗、南天竹、石榴、西番蓮、絲瓜、佛手瓜、商陸、山桃、貼梗海棠、云南山楂、枇杷、西府海棠、球花石楠、杏、紫葉李、冬櫻花、桃樹、光核桃、梅、李、川梨、梨、老虎刺、楊梅、辟荔、大果冬青、冬青、多脈貓乳、棗、葡萄、九里香、花椒、復羽葉欒樹、川滇無患子、清香木、核桃、灑金桃葉珊瑚、頭狀四照花、喜樹、毛葉柿、君遷子、柿樹、糖膠樹、法國冬青、皺葉莢、滇厚殼樹、假煙葉樹、梓、西南貓尾樹、天門冬、山麥冬、銀邊沿階草、沿階草、假檳榔和董棕。
4.5.3色葉樹種
瀘西縣建成區應用較多的常色葉樹種按樹葉顏色可分為紅葉、紫葉類、黃葉類、花葉類，約有42種。紫葉、紅葉類的有紅花木、紅葉石楠、紅葉李、紫錦木、紅葉桃等5種；黃葉類的有金葉假連翹、香冠柏、黃金榕、金葉大花六道木、金森女貞、金葉女貞、千層金、灑金千頭柏8種；花葉類的有花葉假連翹、黃紋萬年麻、花葉萬年麻、歐洲黃梢刺柏、銀姬小蠟、銀心吊蘭、銀邊沿階草、花葉鵝掌柴、花葉榕、花葉葉子花、花葉蔓長春、花葉常春藤等12種。
需要指出的是，由于該區處于南亞熱帶，植物季相變化極不明顯，一些很好的秋色葉植物如楓香、銀杏、西府海棠、垂絲海棠、冬櫻花、川滇無患子、槭樹類等雖然落葉，但落葉期短，基本無秋色葉觀賞價值。
4.5.4特色觀賞植物
（1）萬壽菊。萬壽菊在該地區已形成產業規模，同時花大，具特殊香味，花期長，具有較高觀賞價值，具有瀘西特色。
（2）珙桐。珙桐在園林中應用較少，但在瀘西文化中心綠地中已有批量應用，效果較好。
（3）永椿香槐。永椿香槐也具有較高觀賞價值，為香槐屬發現的一個新種，在向陽鄉有胸徑接近2m的大樹，但目前園林中尚未應用，具有較高開發價值。
（4）紅花木蓮。紅花木蓮具有較高觀賞價值，花果俱美，但由于其對氣候適應性較差，目前園林上使用受到限制，但在瀘西園林中表現良好。
（5）短萼海桐。短萼海桐株型秀麗，花芳香醉人，目前尚未在園林中大量應用，瀘西作為石灰巖分布區域，有較大量短萼海桐野生分布，少量在園林中應用，植株表現良好。
（6）燈盞花。燈盞花也是瀘西高園特色產業的重要組成部分，部分鄉鎮有大量栽培，但目前在園林中尚未發現有應用。
4.6鄉土植物應用
由于良好的適應性、較低的養護管理成本，加上豐富的文化底蘊和明顯的地域特色，鄉土樹種的應用近年來越來越受到重視。
瀘西縣地處北亞熱帶地區，境內野生植物種類繁多，特別是石灰巖山地植物，具有較高代表性。目前瀘西縣建成區應用的鄉土樹種約有177種，主要有腎蕨、云南紅豆杉、山玉蘭、大果木蓮、紅花木蓮、云南擬單性木蘭、猴樟、陰香、香樟、云南樟、野香櫞花、短萼海桐、肋果茶、云南山楂、球花石楠、冬櫻花、蒙自合歡、滇合歡、楓香、杜仲、清香桂、楊梅、鐵橡櫟、滇樸、大果冬青、復羽葉欒樹、川滇無患子、小葉青皮槭、黃連木、清香木、頭狀四照花等。
5討論及建議
（1）大量野生觀賞植物資源有待開發。雖然瀘西縣應用鄉土園林植物種類較多，也一定程度上體現了瀘西特色，但應當看到，這些種類只占應用植物總種類的48.10%，鄉土園林植物的比例還有待提高，按可開發觀賞植物資源種類占植物總種類的1/3計算，光瀘西縣有野生分布的園林植物資源就有700種以上，尚有500種以上有待開發。
（2）加強資金及人才支持力度。一些新建道路、單位、小區的綠化正越來越重視鄉土樹種，鄉土樹種的利用強度正不斷加大，開發利用的種類也進一步增多，呈現趨好發展態勢，但也應看到，瀘西縣尚無專門的公司從事鄉土樹種的引種馴化及開發，限于技術條件、人才引進和資金等問題需要走的路還很長。
（3）提高綠地建設和養護管理水平。特別在以后的植物配置中，可適當增加常綠樹種比例，豐富群落結構，更好地營造北亞熱帶季風氣候的區域景觀。
（4）做好相關規劃編制和實施。做好城市生物多樣性規劃及樹種規劃編制工作，加強規劃的管理控制。
參考文獻：
[1]云南省瀘西縣志編纂委員會.瀘西縣志[M].昆明：云南人民出版社，1992.
[2]吳征鎰.中國種子植物屬的分布區類型[J].云南植物研究，1991，13（增IV）：1～139.
[3]吳征鎰.中國種子植物屬的分布區類型的增訂和勘誤[J].云南植物研究，1993，15（增IV）：141～178.
摘 要：來自哥本哈根大學的安娜.克里斯蒂娜.赫爾特格倫教授基于對世界上四個國家和地區—丹麥，英國，香港和菲律賓的呼叫中心所做的調查，收集了一系列的數據和資料，經過對數據和資料的仔細對比和分析，她得出結論：英語的全球化傳播不一定必須是語言本身替代或者同化了當地語言，也可以通過影響當地言語風格來做到。而言語風格的全球化傳播是社會語言學研究的一個重要的方面，也是還未被充分的意識和研究到的一個方面，筆者嘗試運用禮貌原則去進一步發展赫爾特格倫教授這一觀點，以期引起相關研究人士的注意，去進一步探索這一較新的研究領域。
關鍵詞：呼叫中心，言語風格，全球化，禮貌原則，面子理論
1.引言
關于英語的全球化表現，傳統的觀念是認為英語通過商業，政治和高等教育等途徑，要么取代了當地的語言，要么逐漸與當地的語言實現了共存。然而經最新的研究發現，在語言的傳播中，言語風格獨立于語言本身，得到了發展。言語風格的傳播既非取代當地語言成為一種純粹的英語，也并非是與當地的語言共存，雜糅而成一種新的語言，其中一個典型的例子就是呼叫中心言語風格的全球化傳播。
2.英語的全球化
言語風格的全球化傳播是全球化的社會語言學研究的一個重要的方面，也是卻還未被充分的意識和研究到的一個方面。最近的社會語言學的普遍觀點認為不能僅僅把英語成功取代當地語言與否作為衡量全球化的唯一標準，這一觀點對于語言危險論而言非常重要，因為這個觀點意味著在英語的全球化傳播中，它的成功與否不僅僅是從這個國家的民族語言或者少數民族語言是否得以保存完整來判斷。有的語言它的詞匯或者發音等等方面在英語的全球化沖擊下都沒有發生任何大的變化，但是它在語言風格上卻深受非傳統特征的影響，發生了較大改變。對于全球化的社會語言學研究，其中一個的最大的爭議就在于當地在全球化的壓力下的不同的反擊表現。當地人和當地文化可能是全盤接受，徹底抵觸亦或是介于這兩者之間的程度。
3.以呼叫中心為例
所謂呼叫中心，它是充分利用現代通訊與計算機技術，如IVR（交互式語音800呼叫中心流程圖應答系統）、ACD（自動呼叫分配系統）等等，可以自動靈活地處理大量各種不同的電話呼入和呼出業務和服務的運營操作場所。呼叫中心在目前的企業應用中逐漸被認為是電話營銷中心。電話呼入型呼叫中心的特點是接聽顧客來電，為顧客提供一系列的服務與支持，例如在IT行業中的技術支持中心，保險行業中的電話理賠中心等。呼叫中心是在一個相對集中的場所，由一批服務人員組成的服務機構，通常利用計算機通訊技術，處理來自企業、顧客的電話垂詢，尤其具備同時處理大量來話的能力，還具備主叫號碼顯示，可將來電自動分配給具備相應技能的人員處理，并能記錄和儲存所有來話信息。它作為企業面向客戶的前臺，面對的是客戶，強調的是服務，注重的是管理。充當企業理順與客戶之間的關系并加強客戶資源管理和企業經營管理的渠道。它可以提高客戶滿意度、完善客戶服務，為企業創造更多的利潤。呼叫中心通常首先處理大多數客戶詢問或是基本種類的服務。
呼叫中心作為一種組織原型，發源于美國，也由于美國的強大影響，世界上很多的呼叫中心都采用其話語風格模式，發音也與之努力接近，避免當地化。通過研究發現，全球化的呼叫中心都有一套規約式的講話模式，諸多文件都標明以及對員工的訓練中也是采用統一的風格。但是全球化統一下，不同的當地文化和人民也會對此有著不同的理解和反應。
4.“面子”
赫爾特格倫通過對這四個不同的國家和地區進行的調查和總結發現，盡管地區不同，但是呼叫中心的規約性的言語風格卻非常接近。其中一點就是呼叫中心的工作人員都必須遵循禮貌原則，讓顧客感覺到他們有受到尊重。關于禮貌原則，利奇（Geoffery Leech，1983）提出過他的禮貌原則：（1）得體準則：盡量少讓別人吃虧，盡量讓別人多得益。（2）慷慨準則：盡量少讓自己得益，盡量多讓自己吃虧。（3）贊譽準則：盡量少貶損別人，盡量多贊譽別人。（4）謙遜準則：盡量少贊譽自己，盡量多貶損自己。（5）一致準則：盡量減少雙方的分歧，盡量增加雙方的一致。（6）同情準則：盡量減少雙方的反感，盡量增加雙方的同情。Brown和Levinson將“面子”定義為“每一個社會成員意欲為自己掙得的一種在公眾中的個人形象”（Brown& Levinson，1987）。他們認為每個交際參與者都具有兩種面子：積極面子（positiveface）和消極面子（negative face）。積極面子是希望得到別人的贊同、喜愛、欣賞和尊敬；消極面子是指不希望別人強加于自己，自己的行為不受別人的干涉、阻礙，有自己選擇行動的自由。（Brown & Levinson，1987）。他們認為在會話過程中談話雙方的兩種面子都會受到侵襲，即說話人和聽話人同時面臨著積極面子和消極面子的威脅。因此，絕大多數言語行為都是威脅面子的行為（Face Threatening Acts，FTA）（Brown &Levinson，1987），而禮貌的會話功能就在于保護面子，降低面子威脅行為的威脅程度。在交際中，一方面，說話者必須要關注對方，或向對方給予關注；另一方面，說話者要維護一定的獨立性，同時對對方的獨立需求也表示尊重。呼叫中心規定要讓打電話的人（顧客）感覺到有被傾聽，給足客人面子，這很關鍵。而且在多數情況下，僅僅做到消極面子還遠遠不夠，與客人的交談中，在允許的情況下還要進行移情（設身處地地為顧客考慮，站在顧客的角度看待問題）；在等待問題處理的間隙，談點與待處理的問題無關的話題也不錯，最好帶有當地色彩。
5.結束語
面對被英語同化的壓力，這里似乎并沒有一個全球的合約表明要去建立一個合適的“呼叫中心風格”，但是在英語的全球化傳播中，語言風格確實獨立于語言本身也得到了傳播，這使得諸多國家都深受英語風格的影響，通通采用這一風格，然后用自己的語言表達出來。而對于社會語言學家而言，對呼叫中心的規約性言語風格的研究，其研究價值就在于：分析不同語言下的規約性言語風格，找出它們的共通點。語言的統一并非一定使人們去講一種統治語言，而是采用他人的一種可以令多數人都能接受的言語風格，用自己的語言表達出來，所以全球化并不等同于語言和文化的同化，也可能是是在全球化的過程中影響到當地的言語風格。當然無論是英語語言本身的傳播亦或是英語言語風格的傳播，很大程度上都是由于資本主義的力量的影響而造成的。（作者單位：重慶師范大學外國語學院）
參考文獻
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[3] Brown， Penelope and Stephen C.Levinson.1987. Politeness：Some Universals in Language Usage. Cambridge U.K：Cambridge University Press.
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[6] Pennycook，Alastair. 2010. Language as Lical Practice.Abingdon， U.K：Routled
[6] Leech， G. Principles of Pragmatics，London： Longman，1983.
[7] 賀蕓，莊成余，論英語全球化傳播的原因及其影響，云南師范大學學報，2004
關鍵詞：顯性標記；廣兩優476；純度鑒定
中圖分類號：S339.3；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5884-03
廣兩優476是利用不育系廣占63-4S和恢復系R476配組育成的兩系中秈新組合，具有產量高、品質優和熟期適宜等特點，并于2010年3月通過了湖北省農作物品種審定委員會的審定[1]。2011-2013年，廣兩優476連續3年被湖北省農業廳確定為水稻主導品種之一，正在生產上大面積推廣應用。
由于光溫敏不育系在自然環境條件下易受到光溫等條件的影響，因此在制種期間若出現異常低溫可能引起不育系育性波動，導致不育系部分自交結實從而影響雜交種子的純度；另外，由于制種時隔離不嚴，或收獲、裝運等環節人為因素的影響，也可能造成串粉混雜或機械混雜。因此，探索一種簡單、準確、快速地鑒定兩系雜交稻種子純度的方法是保證兩系雜交稻安全推廣應用的關鍵環節。
分子標記鑒定雜交水稻種子純度已有不少報道[2-4]，但大多是利用共顯性SSR標記，由于SSR標記往往在親本間差異較小，需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳或高分辨率的瓊脂糖凝膠電泳才能區分。這就增加了分子檢測的難度和鑒定成本，而一般的顯性標記對于某一個品種來講由于特異性不強而無法使用。抗褐飛虱基因Bph14來自于野生稻，已經被定位[5]和克隆[6]，與其緊密連鎖的分子標記MRG2329也已經成功應用于分子標記輔助育種中，通過分子標記輔助選擇鑒定了育成的恢復系R476及其雜交組合廣兩優476帶有抗褐飛虱基因Bph14[7，8]。本研究針對雜交組合廣兩優476，利用Bph14基因特異的顯性標記76-3對種子純度鑒定的方法進行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料
不育系廣占63-4S、恢復系R476和廣兩優476種子采自湖北鄂科華泰種業股份有限公司制種基地。不同制種田收獲的種子編號后隨機抽樣分成2份，一份在海南省進行田間種植鑒定，設計3次重復，每重復單本種植500苗；另一份取200粒種子浸種催芽后放置培養箱中生長，1周后取單株葉片，采用CTAB法[9]從葉片中提取DNA，利用顯性標記76-3鑒定種子純度。
1.2 試劑
Taq酶、dNTPs、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖等均購自寶生物工程（大連）有限公司；MRG2329引物序列由武漢大學何光存教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。
1.3 PCR擴增
PCR反應體系為：1.5 μL 10×PCR Buffer （100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，pH 8.3），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.6 μL 上、下游引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），1.0 μL 模板DNA，補ddH2O至15 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s，退火 30 s（MRG2329的退火溫度為60 ℃，76-3的退火溫度為58 ℃），72 ℃延伸1 min，35個循環； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存備用。MRG2329的PCR擴增產物用0.6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測[7]，76-3的PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2 結果與分析
2.1 分子標記MRG2329和76-3在廣兩優476親本及雜交種中的多態性
MRG2329為共顯性標記，PCR擴增產物片段大小為180 bp，由于親本間差異較小，需使用聚丙烯酰胺凝膠電泳才能分辨，電泳結果見圖1a。含Bph14基因的恢復系R476片段稍大，不育系廣占63-4S的片段較小，雜交種廣兩優476為雜合帶，利用MRG2329擴增片段大小的差異能將恢復系、不育系和雜交種區分。76-3為顯性標記，PCR擴增產物片段大小為570 bp，電泳結果見圖1b。含Bph14基因的恢復系R476和雜交種廣兩優476有擴增產物，不育系廣占63-4S無擴增產物，利用擴增產物的有無能將雜交種和不育系區分，因此用顯性標記76-3可以檢測出雜交種中混雜的不育系種子。
2.2 利用顯性標記76-3鑒定雜交水稻廣兩優476種子的純度
為了便于操作，每組樣品隨機提取94個單樣，以父本R476和母本63-4S分別作為陽性和陰性對照，利用顯性標記76-3對待測樣品進行檢測，PCR擴增時使用96孔PCR板，擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為了節約成本，第一次點樣的產物在200 V電壓下電泳20～30 min后進行第二次點樣，電泳結束后拍照統計無擴增產物樣的個數（圖2）。1號樣品的檢測結果，第52個樣和第86個樣與對照63-4S （第95個）無擴增產物，表明94個檢測樣品中鑒定出2個不育系，最后計算出1號樣品種子的純度為97.9%（表2）。
2.2 分子標記鑒定與田間種植鑒定結果的比較
本研究中田間鑒定的結果見表2。從表2中可以看到，3次重復的平均值與分子鑒定結果之間存在一定的差異，兩者的差值在-7.9～2.4之間。13號樣品分子鑒定純度比田間鑒定純度高出7.9個百分點。部分樣品的田間鑒定純度大于分子鑒定純度，如4號、5號、7號、9號、10號和12號；另一部分樣品的田間鑒定純度小于分子鑒定純度，如2號、3號、6號、11號和13號，只有1號和8號樣品的田間鑒定與分子鑒定結果相同。在13個樣品中，除3號、4號和13號外，其他樣品的田間鑒定與分子鑒定結果差值都在1個百分點內，說明分子鑒定的結果基本能反映出所鑒定樣品的種子純度。同時從表2還可看到，田間鑒定3次重復的結果也存在一定的差異，重復間差異最小的是4號，其差值在0.4%～1.0%之間，差異最大的是5號，其差值在2.4%～13.2%之間；田間鑒定與分子鑒定差異最大的是13號，3次重復間的差異也較大，其差值在5.4%～10.8%之間，說明抽樣過程中不同的樣本帶來的鑒定結果的差異是不可避免的，只有通過加大檢測樣本或取平均值的方法來加以修正。
3 小結與討論
3.1 顯性標記鑒定雜交稻種子純度的優點
在兩系雜交稻制種過程中，如果隔離條件符合技術要求，并且沒有發生機械混雜，對種子純度產生影響的因素主要是不育系自交結實。在這種情況下利用恢復系特異的顯性標記就能準確鑒定種子純度。與田間鑒定相比，待測樣品在培養箱中生長1周后就可以提取葉片DNA，縮短了鑒定時間。與共顯性標記相比，顯性標記只需判斷PCR擴增產物的有無，容易識別，而且電泳時間短，一排點樣孔上可多次上樣，節約了時間和成本，提高了效率。
3.2 影響分子鑒定結果準確性的因素
在田間鑒定中發現廣兩優476中有少量的秈粳交雜株、異型株和恢復系。對于串粉混雜和異型株等類型的雜株，由于不帶有Bph14基因，用顯性標記76-3鑒定時這類雜株與混雜的不育系一樣擴增不出目的條帶，只能鑒定為雜株而無法判定是哪種類型，但并不影響鑒定的結果；對于混雜的恢復系，由于帶有Bph14基因，用76-3也能擴增出目的條帶，無法與真雜種區分，可能會影響鑒定結果。本研究中只在2號和9號樣品中各發現了1株恢復系，所占比例較小，對分子鑒定結果并未產生影響。而恢復系對雜交種子純度的影響，在制種過程中可以通過嚴格管理人為控制。
用顯性標記76-3鑒定廣兩優476種子純度，擴增無目的條帶即判定為雜株，但由于DNA質量的問題也可能引起擴增無條帶，增加了雜株的比例。這就要求在提取DNA時，保證所提取DNA的質量。由于無擴增條帶的樣品所占比例較少，還可以使用顯性標記MRG2329將這些樣品重新檢測一次，排除DNA的影響，確定雜株的數量。
統計學上一般抽樣的樣品數量越多統計數與總體參數之差就越小。在實際工作中，只要誤差在允許范圍內，抽樣數量要盡可能小，否則工作量加大，會相應增加檢測費用[10]。根據現行國家標準GB/T 3543.5-1995中對聚丙烯酰胺凝脈電泳法測定大麥、小麥種子純度的規定，一般每個樣品測定100粒種子[11]。在本研究中PCR擴增時使用的是96孔板，每次擴增94個待測樣品，如果鑒定結果在90%以下，可直接判定為種子純度不合格，如本研究中的3號、5號和13號樣品。如果鑒定結果在96%左右（根據國家規定標準雜交稻種子純度不低于96%），可根據需要重新提取DNA再檢測94個樣品或更多的樣品。
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