時間：2022-04-10 14:30:49
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇血清學檢測，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
方法：對醫院送檢的383例高膽紅素血癥新生兒血液標本進行“三項試驗”，即直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗、抗體釋放試驗。
結果：383例新生兒溶血病患者中，直接抗人球蛋白試驗陽性率為53.12%，游離抗體試驗陽性率為71.54%，抗體釋放試驗陽性率為83.29%。
結論：釋放試驗敏感度最高，是判定新生兒溶血病最有力的實驗室證據。
關鍵詞：幼紅細胞增多癥 胎兒 血清學 直接抗人球蛋白試驗 游離抗體試驗 抗體釋放試驗
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.538
【中圖分類號】R9 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2013）08-0463-02
新生兒溶血癥（hemolytic disease of the newborn，HDN）是指母嬰血型不合，母體血液中針對胎兒紅細胞的免疫抗體IgG通過胎盤進入胎兒循環，發生同種免疫而引起的溶血。在人類已發現的血型系統中，以ABO血型系統不合引起的新生兒溶血病最常見，其次為Rh血型系統。新生兒溶血病的臨床表現輕重不一，取決于抗原性的強弱、個體的免疫反應、胎兒的代償能力和產前的干預措施等因素。Rh溶血病臨床表現較為嚴重，進展快，而ABO溶血病的臨床表現多數較輕。Rh溶血病一般不發生在第一胎，而ABO溶血病可發生在第一胎。HDN的血清學檢測對該疾病的臨床診斷具有重要的價值。筆者就我市近年來發生的383例HDN的血清學檢測結果分析報告如下。
1 材料與方法
1.1 標本來源。2010年1月～2013年1月本市4家醫院送檢的臨床高膽紅素血癥或母親血型為Rh陰性的HDN患兒383例，標本為患兒及母親血液。
1.2 試劑。抗-A（B）血清（長春生物制品研究所）；抗-D、抗人球蛋白試劑（廣譜）、單克隆IgG、單抗C3（上海市血液中心）；ABO標準紅細胞（本站自制）。
2 結果
383例新生兒溶血病患者中，直接抗人球蛋白試驗陽性率為53.12%，游離抗體試驗陽性率為71.54%，抗體釋放試驗陽性率為83.29%。
3 討論
3.1 發病原因。由于母親的血型與胎兒（或嬰兒）的血型不合，如Rh血型不合或ABO血型不合引起同族免疫性溶血病，Rh血型不合所致溶血常較ABO血型不合為嚴重。
3.1.1 Rh血型不合。Rh血型不合引起的新生兒溶血癥在中國的發病率較低。通常是母親為Rh陰性，胎兒為Rh陽性而血型不合，并引起溶血，一般第一胎不發病，而從第二胎起發病，但如果Rh陰性的母親在第一胎前曾接受過Rh陽性的輸血，則第一胎也可發病。
3.1.2 ABO血型不合。該病以ABO血型不合最常見，其中最多見的是母親為O型，胎兒（或嬰兒）為A型或B型。第一胎即可發病，分娩次數越多，發病率越高，且一次比一次嚴重。尚可見于母親為A型，胎兒（或嬰兒）為B型或AB型，或母親為B型，胎兒（或嬰兒）為A型或AB型，但少見。胎兒（或嬰兒）為O型者，可排除該病。
3.2 發病機制。胎兒由父親方面遺傳來的顯性抗原恰為母親所缺少，胎兒血因某種原因進入母體，母體產生相應的IgM抗體，當胎兒血再次進入母體，母體發生次發免疫反應，產生大量IgG抗體，通過胎盤進入胎兒，使胎兒、新生兒發生溶血。只要0.1～0.2ml的胎兒紅細胞進入母體循環就足以使母親致敏。
3.2.1 Rh血型不合溶血病。多數是母親為Rh陰性，但Rh陽性母親的嬰兒同樣也可以發病。第一胎發病率很低，因為初次免疫反應產生IgM抗體需要2～6個月，且較弱，不能通過胎盤進入胎兒體內，而胎兒紅細胞進入母體多數發生在妊娠末期或臨產時，故第一胎常處于初次免疫反應的潛伏階段。當再次妊娠第2次發生免疫反應時，僅需數天就可出現，主要為IgG能通過胎盤的抗體，并能迅速增多，故往往第二胎才發病。Rh系統的抗體只能由人類紅細胞引起，若母親有過輸血史，且Rh血型又不合，則第一胎也可發病。母親的母親（外祖母）為Rh陽性，母親出生前已被致敏，則第一胎也可發病，此即外祖母學說。
3.2.2 ABO血型不合溶血病。多數是母親O型、胎兒A型或B型；少數為母親A型、胎兒B型或AB型，或母親B型、胎兒A型或AB型時發病。因為A或B型母親的天然抗A或抗B抗體主要為不能通過胎盤的IgM抗體，而存在于O型母親中的同種抗體以IgG為主，因此ABO溶血病主要見于O型母親、A或B型胎兒。ABO溶血病可發生在第一胎，這是因為食物、革蘭陰性細菌、腸道寄生蟲、疫苗等也具有A或B血型物質，持續的免疫刺激可使機體產生IgG抗A或抗B抗體，懷孕后這類抗體通過胎盤進入胎兒體內可引起溶血。由于A和B抗原也存在于紅細胞外的許多組織中，通過胎盤的抗A或抗B抗體僅少量與紅細胞結合，其余都被其他組織和血漿中的可溶性A和B血型物質的中和和吸收，因此雖然母嬰ABO血型不合很常見，但發病者僅占少數。
在383例新生兒溶血病患者中，抗體釋放試驗陽性率（83.29%）、游離抗體試驗陽性率（71.54%）與文獻報道的釋放試驗陽性率為88.0%、游離試驗陽性率為69.16%大致相同，但直接抗人球蛋白試驗陽性率（53.12%） 高于文獻報道（39.12%），可能與所用試劑、儀器及血樣采集時機和來源不同有關[1]。研究結果證實釋放試驗是“三項試驗”中敏感度最高，也是判定HDN 最有力的證據[2]。抗體釋放試驗操作比較繁瑣，耗時較長，在實際工作中應仔細認真，否則可能得到錯誤的結論。研究結果還表明，直接抗人球蛋白試驗比游離抗體試驗更具有診斷價值，因為，直接抗人球蛋白試驗陽性說明紅細胞已經被血清中的游離抗體致敏。在383例的HND患者中，“三項試驗”結果分布規律為直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗、抗體釋放試驗同時呈陽性所占比例較低；游離抗體試驗、抗體釋放試驗均陽性所占比例次之，抗體釋放試驗陽性者占比例最高。單是直接抗人球蛋白試驗陽性者，就可以確認HDN。如果單是直接抗人球蛋白試驗陰性，還需要做游離試驗或者釋放試驗進一步確診。
參考文獻
方法：選取我院2010年5月至2012年5月38例正定型為O型的待檢標本，分別對其血型亞型的血清學檢測結果進行統計學分析。
結果：檢出A亞型占26.2%；B亞型占73.8%，兩組檢出率對比差異明顯（P
結論：對ABO血型亞型進行血清學檢測和鑒定，可以有助于降低對亞型患者進行輸血時的風險性。
關鍵詞：ABO血型亞型血清學檢測輸血安全
【中圖分類號】R-1【文獻標識碼】B【文章編號】1671-8801（2013）04-0307-01
ABO亞型由于紅細胞上的A或者B抗原相對較弱，往往在獻血者/患者交叉配血不相合或者正反定型不相符的情況下方才發現。本文通過觀察分析ABO血型亞型檢測及血清學特點，總結其臨床意義如下：
1資料與方法
1.1一般資料。選取我院2010年5月至2012年5月38例正定型為O型的待檢標本，分別對其血型亞型的血清學檢測結果進行統計學分析。均排除由其它原因導致的正反定型不符的患者。男有20例，女有18例，年齡在25～71歲，平均年齡為40.5±4.9歲。
1.2方法。
1.2.1血型血清學檢測方法。①嚴格質控下使用全自動血型/配血系統，規范進行血型檢測。②ABO血型系統抗體和紅細胞ABH抗原試管法檢測：取4個潔凈試管，先做好標記，分別向試管內加入抗-H、抗-AB、抗-B、抗-A血清，在疑似A2亞型時還需多加一個試管，加入抗-A1血清，并對每個待測試管中加入1滴3～5%的被檢紅細胞鹽水懸液，輕輕混勻后，使用離心機以1000r/min的轉速進行離心試驗15s，再取出4個潔凈的試管，同樣做好標記后，往里面滴入2滴經離心試驗后的被檢血清，還需要在每個試管中再加1滴3～5%的A1或A2或Bc或Oc的試劑紅細胞，再次使用離心機以1000r/min的轉速進行離心試驗15s，觀察試驗結果。
1.2.2放散與吸收試驗。①吸收試驗：使用生理鹽水對壓積紅細胞1ml進行洗滌≥3次，最后1次洗滌后，將試管中的紅細胞沉淀后的上清液盡量棄掉，然后在試管中加入抗-A血清或抗-B血清1ml，充分混勻后，放置在4℃下進行2h孵育，期間保持對試管進行輕搖，充分混合抗體血清和紅細胞；再使用離心機以1760r/min的轉速進行離心試驗5min，將血清與紅細胞分開放入2個不同的潔凈試管中，對紅細胞使用4℃的生理鹽水進行洗滌，最后一次洗滌后再次使用離心機進行離心試驗分離出上清液，最后采取3%的反定細胞對其中殘留的游離抗體進行檢測。②熱放散試驗：對經過等體積生理鹽水洗滌并經過上述吸收試驗后的紅細胞，給予56℃下進行熱放散試驗，取出上清液并均分為3份，分別標記為A、B、O試管，并對應加入1滴試劑紅細胞，觀察試驗結果。
1.2.3凝集機制試驗：屬于分泌型的患者給予唾液ABH物質測試，分別取4個潔凈的硬質塑料試管，分別為生理鹽水、非分泌型標本、分泌型標本、受血者標本，并分別滴入50μl經倍比稀釋后為2+抗體強度的血清，放置在室溫下進行10min孵育，然后對每個試管中加入50μl的經洗滌后3～5%的ABO標準紅細胞懸液，放置在室溫下進行30min孵育，接著使用離心機以1000r/min的轉速進行離心試驗15s，觀察試驗結果。
【中圖分類號】R737．31
【文獻標識碼】A
【文章編號】 1673-7555[2007]01-0045-03
卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，因卵巢位于盆腔內，癌早期無癥狀，一旦出現臨床癥狀，常失去治療時機，故急需尋找一種早期正確診斷的方法。近年研究發現卵巢癌患者血清中含有腫瘤相關因子，來源于原發腫瘤的DNA。由于血清標本來源方便和非侵入性等優點逐步替代組織學腫瘤標記的檢測。腫瘤的發生是由遺傳因素及環境因素兩方面決定，可以檢測卵巢癌患者血清中遺傳學改變，為卵巢癌早期診斷及預后監測提供新依據。
1腫瘤患者血清中基因改變的研究
1．1血清游離DNA的來源 上世紀60年代，首次在紅斑狼瘡患者血漿中發現游離DNA及其抗體，近年研究發現惡性腫瘤患者血清及血漿中DNA含量明顯高于良性疾患，并在惡性實體腫瘤患者血清DNA中檢測到與相應的原發腫瘤相一致的細胞遺傳學改變，從而使外周血DNA的研究受到了前所未有的重視。關于腫瘤外周血DNA的來源及其發生機制主要有以下四種假說。①循環腫瘤細胞或微轉移灶的裂解：據推算，在胰腺癌患者血清中如果能測及DNA時，每毫升血液中至少含有1000～10000個腫瘤細胞，顯然外周血中沒有足夠的腫瘤細胞產生如此高水平的DNA，故這種假說不能完全解釋腫瘤患者外周血中DNA的來源。②腫瘤細胞的壞死；有證據表明在瘤體較大的患者或發生轉移的晚期患者的血漿中可以檢測到高水平的外周血DNA，因此推測外周血DNA有可能來源于腫瘤細胞的壞死。可是有些早期腫瘤患者能檢測到外周血DNA，而且腫瘤患者在接受化療時外周血DNA不因腫瘤細胞壞死而增加，有時反而明顯降低，故腫瘤細胞的壞死亦不是外周血DNA的惟一來源。③腫瘤細胞的凋亡：由于血漿DNA電泳后表現出凋亡細胞所特有的梯度條帶，一些學者提出了外周血DNA來源于腫瘤細胞凋亡的觀點。④細胞自發性釋放DNA：淋巴細胞或離體培養的器官能通過一種自我平衡機制自發釋放白復合物，并優先釋放細胞內新合成的DNA。據此有學者推測腫瘤循環DNA可能也會以同樣方式釋放人血。目前，關于腫瘤患者外周血DNA的來源還不能具體確定，具體來源及機制還有待于今后的實驗研究進一步證實。
1．2卵巢癌患者血清游離DNA微衛星變化的研究近年研究表明，血清中游離DNA存在著微衛星變化，微衛星變化包括微衛星位點雜合性丟失(Lossof-Heterozy2gosity，LOH)和微衛星不穩定(mierosate insta－biliry，MS1)，微衛星不穩定性(MS1)是近來發現惡性腫瘤普遍存在的現象[2,3]，是繼癌基因激活和抑癌基因失活后又一新的腫瘤發生機制。微衛星(mierosat－ellite，MS)是短串核苷酸的簡單重復序列，重復單位為2～6個核苷酸，重復次數在20～100左右。MSI是在DIMA復制過程中，由于刪A鏈的滑動，導致MS中重復單位的插入和缺失，引起任何MS長度的改變，出現新的微衛星等位基因。MSI是人類錯配修復基因變異導致基因組不穩定的重要表現形式。近年來，大量文獻提示了卵巢瘤組織的3p、6q、8 q、9q、13q、X染色體微衛星位點均有頻繁的等位基因雜合性丟失(LOH)，且該類染色體特定或附近區域可能存在著某些與卵巢癌相關的候選抑癌基因。現將其部分研究結果總結敘述如下：
1．2．1卵巢癌患者血清DNA與腫瘤組織DNA3號染色體(3p14．25)變化 腫瘤分子生物學的深入研究表明，卵巢癌組織中出現高頻率的3號染色體短臂(3p14，25)等位基因缺失，提示該區域可能存在與卵巢癌相關的抑癌基因[7,8 3]。張華等[9]研究以卵巢癌患者血清標本為DNA來源并結合相應的癌組織標本，分別對3p14，25的4個微衛星位點，(D3S1029、D3S1228、D3S1300、D3S1481)進行雜合性丟失檢測，其研究結果表明：卵巢癌的發生與卵巢癌患者血清DNA與腫瘤組織DNA3p14，25出現雜合性丟失密切相關，血清3p14，25出現雜合性丟失率與卵巢癌惡性程度有關。在3014－21區域存在著SEMA3B、RASSF1A等抑癌基因。Xiang R及Tsc等[10]。研究發現在多種惡性腫瘤包括腎瘤、肺癌、等惡性腫瘤中均出現該區域多個微衛星位點的LOH。徐軍等研究3號染色體(3p14)等位基因的LOH，他們選擇3014上的3個微衛星位點(D3S1234、D3S1300、D3S1312)，結果在所檢測的樣本中發生至少1個位點缺失的百分率為67．7％，發生2個微衛星位點缺失的為35．5％。
1．2．2卵巢癌組織17號染色體(17p13．1，17 q211)的微衛星不穩定性(MSl)梁惠琪、關明等利用新鮮卵巢癌組織及癌旁正常組織的DNA中，用聚合酶鏈反應(PCR)擴增17號染色體上5個微衛星位點，它們都是(cA)n二核苷酸重復序列，D17S513、TP53、D17S855、D17S806和D17S579，分布于17號染色體不同位置。D17S513位于17號染色體端粒處，TP53定位于17013．1，在p53附近，D17S855、D17S806和17S579定位于17q21．1，在BRCA 1附近。用單鏈構象多態性(Single St rand Confo rmat ion Po lymo rphism，SSCP)分析法檢測微衛星不穩定性(MSl)，并用銀染方法顯示結果。其結果表明17號染色體定位于抑癌基因BRCA 1附近的3個微衛星位點以及p53附近的微衛星位點均頻繁地出現MSI。證實了頻繁發生微衛星不穩定的染色體區域附近，可能存在抑癌基因，并且有可能引起抑癌基因功能的喪失。
1．2．3卵巢癌患者血清DNA抑癌基因BRCAI／TP53基因雜合性丟失LOH) 高海峰、傅士龍等選用了位于17號染色體上的兩個抑癌基因BRCAI及TPP3中四個微衛星位點對卵巢癌患者血清DNA及其相應腫瘤組織DNA的BRCA1／TP53等位基因雜合性丟失(Loss of Heterozy 2 gosity，LOH)的研究，結果提示卵巢癌患者血清DNA與腫瘤組織DNA中BRCM及TP53基因LOH密切相關，從而證實了卵巢癌患者血清DNA主要來源于原發腫瘤組織。近年來的研究表明腫瘤患者血液NA濃度顯著高于正常人群，并提示體液包括血清、血漿及腹水。DNA中高頻率遺傳學標志變異的檢測對于監控疾病具有一定的臨床意義，因此血清DNA微衛星變異分析被人們認為是一種具有潛在性臨床應用價值的分子檢測方法。
2卵巢癌患者血清蛋白質類改變的研究
卵巢癌患者血清中蛋白類異常改變主要為促進
細胞增殖因子、促進新血管形成的因子及各種酶類異常表達。實體腫瘤是依賴血管性腫瘤，血管為腫瘤提供營養和轉移途徑，在沒有新生血管之前，腫瘤只能生長到1～2mm，不能發生轉移，在新生血管后，腫瘤會呈指數倍增長，轉移機會也隨之增加。現就與實體腫瘤血管形成密切相關的兩個因子進行敘述，即血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)：
2．1血管內皮生長因子(VEGF) VEGF是已知的作用最強、最專一的血管生成促進因子之一。Pdlar等[16]分析了68例臨床Ⅰ、Ⅱ期的卵巢癌患者的VEGF表達水平，發現VEGF陽性者平均生存期為22個月，而陰性者的平均生存期大于108個月，兩者的平均生存期限有著極顯著性差異(P
2．2堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) 堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblasffactor，bFGF)是一種具有促進有絲分裂，能夠促進包括內胚層、中胚層和神經內胚層來源的多種細胞和組織生長、分化，同時具有促進傷口愈合、組織修復和血細胞生成等生理功能。bFGP可能通過下面兩種主要機制參與腫瘤的形成和發展：①通過過表達bFGP，而以自分泌和旁分泌方式促進細胞過渡增殖和腫瘤生長。②通過促進新生血管形，為腫瘤細胞生長提供豐富營養。李萍、李新鳴等研究發現卵巢癌CAOV3細胞經bFGF處理，細胞增殖比明顯增加，且與bF6P水平呈劑量依賴關系。
3卵巢癌患者血清檢測的意義及前景
【關鍵詞】 脂肪肝；肝功能；血脂血清學指標；診斷；應用價值
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.15.020
隨著人們生活水平的提高， 飲食結構的改變， 臨床脂肪肝的發病率呈上升趨勢。由于脂肪肝患者無明顯的臨床癥狀， 但其肝功能和血清學指標發生變化[1]。本次研究選取2016年1～8月本院收治的42例脂肪肝患者作為研究對象， 探討肝功能和血脂血清學指標檢測在臨床診斷脂肪肝的應用價值， 現報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選取2016年1～8月本院收治的42例脂肪肝患者作為研究對象， 將其設為觀察組， 納入標準：患者肝臟經影像學檢查， 符合彌漫性脂肪肝的診斷標準；經活檢符合中華醫學會肝臟病學會中脂肪肝的診斷標準[2]；同時選取同期在本院接受健康體檢的40例健康者作為對照組， 兩組受試者對本次研究知情且均已簽署知情同意書。觀察組中男24例， 女18例， 年齡21～70歲， 平均年齡（42.1±10.5）歲；
對照組中男23例， 女17例， 年齡22～72歲， 平均年齡（42.9±
11.7）歲。兩組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 方法 清晨在受試者空腹狀態下抽取5 ml靜脈血， 應用離心機進行離心， 離心速率為3000 r/min， 將血清儲存于冰箱中-20℃儲存， 應用全自動生化分析儀（廠家：羅氏， 型號AU5400）， 按照試劑盒上說明書進行操作。
1. 3 觀察指標 對兩組AST、ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C指標進行觀察并比較。
1. 4 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢測；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢測。P
2 結果
2. 1 兩組受試者的肝功能血清學檢測結果比較 觀察組AST、ALT水平分別為（82.25±4.54）、（57.35±6.46）U/L， 均明顯高于對照組的（42.22±3.56）、（26.04±3.35）U/L， 差異具有統計學意義（P
2. 2 兩組受試者的血脂血清學檢測結果比較 觀察組TG、TC水平均明顯高于對照組， 差異具有統計學意義（P0.05）。見表2。
3 討論
近年來脂肪肝疾病發病率呈上升趨勢， 給人們的身體健康構成嚴重威脅。肝臟是人體代謝主要器官， 肝臟功能下降時， 機體的轉運功能明顯降低， 肝臟內脂類物質沉積， 導致脂肪肝的發生[3]。脂肪肝的臨床表現呈現多樣化， 常見的有惡心嘔吐、食欲下降、上腹隱痛等， 若不及時治療可能發展為肝硬化甚至危及生命， 早期診斷對臨床治療有非常重要的作用[4]。
臨床應用肝活組織進行穿刺檢查， 給患者帶來極大的痛苦， 且風險較大。應用肝功能和血脂血清學檢查， 該方法無創， 且ALT和AST能反應肝細胞的受損程度。本次研究結果表明， 觀察組AST、ALT、TG、TC水平均明顯高于對照組， 差具有統計學意義（P
綜上所述， 通過檢測肝功能和血脂血清學等指標， 能反映脂肪肝患者的病情， 給臨床診斷提供理論依據。
參考文獻
[1] 劉云霞.脂肪肝診斷中肝功與血清學指標檢驗的應用價值分析.臨床醫學研究與實踐， 2016， 1（17）：88-89.
[2] 張曉紅.肝功與血脂血清學指標水平檢測在脂肪肝診斷中的應用分析.中外醫學研究， 2015， 13（10）：56-58.
[3] 邢敏， 楊自力.血脂、血糖、肝功能等生化指標聯合超聲診斷脂肪肝及評估其預后的價值.肝臟， 2016， 21（4）：327-328.
關鍵詞：血清學方法；包蟲病；預防控制
包蟲病多見于新疆、內蒙和青海等農牧區，導致棘球絳及其幼蟲寄生人體的原因有農牧民習俗和等原因。隨著包蟲病感染病例的增多，也使得醫療機構提高了預防控制包蟲病流行的力度。而影像檢查技術不容易及時發現囊腫或腫塊從而導致誤診，本文將探討通過檢測包蟲病患者血清的免疫學方法對該病進行檢測，以達到預防控制包蟲病流行的效用；現報道如下。
1資料與方法
1.1抗原與血樣 從新宰綿羊肝臟或肺臟提取棘球蚴囊液，用pH 9.6的碳酸鹽稀釋使其蛋白質含量達到50 μg/ml；采用預包被板和包蟲病抗體檢測試劑盒等。血樣采自流行病學調查現場，經我B超和X線檢查確診的120例包蟲病患者的血清各取5 ml，也抽取非包蟲病體檢者陰性血清作為參照，血清經分離后保存待用。
1.2檢驗方法 檢測方法有：點酶聯免疫吸附檢驗（Dot-ELIS）和微量間接血凝檢驗法（IHA），酶聯免疫吸附檢驗（ELISA）和EM18免疫印漬檢驗（EM18-ELIB）。②Dot-ELIS檢驗將抗原吸附在PVC反應板表面，待充分反應后用洗滌法徹底清除游離殘余。②IHA檢驗抗原載體經金屬陽離子靜電作用讓蛋白質與紅細胞表面結合達到致敏效果，并在微量滴定板上以1：64比例稀釋再加入致敏紅細胞懸液1滴，混勻1～2 h后觀察紅細胞凝集程度以確定陽性反應孔為滴度終點。③ELISA檢驗將棘球蚴囊液抗原稀釋至每孔內含蛋白質10 μg/ml，其中IgG抗原酶結合物工作濃度為1：200。顯色采用TMBS底物，陽性臨界值以x+3s≥陰性為對照。④EM18-ELIB檢驗抗原采用泡型包蟲原頭蚴粗抗原，SDS-PAGE電泳結束后再轉至NC膜制成抗原膜條，再用所制成的抗原膜條做Western Bolt檢驗，血清稀釋比例為1：100，IgG抗原酶結合物按1：100比例稀釋然后經BA底物顯色反應后，若8 kDa處出現反應帶可判斷為陽性。
1.3數據處理 采用SPSS17.0軟件處理實驗數據，計量資料使用（x±s）表示，進行t檢驗；計數資料使用χ2檢驗；以P
2結果
2.1不同血清檢驗方法的檢測結果 經B超和X線影像學檢測確診的120例包蟲病患者，應用不同血清檢驗方法檢查的結果中，囊型包蟲病和泡型包蟲病各有109例和11例，其中對泡型包蟲病使用Dot-ELIS、IHA、ELISA該3種血清檢驗法與B超和X線影像學檢測結果等同，Dot-ELIS、IHA、ELISA和EM18-ELIB這4中血清檢驗法也與上述檢測方法所得出的結果等同，見表1。
2.2不同血清學方法對包蟲病患不同位置的檢測結果 肺臟包蟲病患者應用囊型包蟲抗原IHA檢測血清陽性率低于其它部位血清陽性率，但Dot-ELISA檢驗和IHA檢驗及ELISA檢驗所檢出的血清陽性率相近，見表2。
3討論
包蟲病容易寄生于人體組織和器官以至于臨床難以依據病原學進行確診，所以臨床對于包蟲病的檢測通常將查體和影像學以及免疫學等檢驗結果做綜合性判斷。影像學檢驗雖然能夠有較高檢出率，但影像檢查技術不容易及時發現囊腫或腫塊從而導致誤診。而包蟲病作為地方性疾病，由于感染病例的增多也相應提高臨床對其的重視程度。
本次探討中不同檢驗方法對囊型和泡型包蟲病敏感程度也不盡相同，其中Dot-ELISA抗原和IHA抗原對于該兩型包蟲病的敏感度相似。對泡型包蟲病使用Dot-ELIS、IHA、ELISA該3種血清檢驗法與B超和X線影像學檢測結果等同，但ELISA抗原檢出囊型包蟲陽性率低于Dot-ELISA和IHA檢驗法，說明該兩種囊型包蟲生理和生化代謝各異。因此，需要在臨床診斷中加強檢測的敏感度。
泡球蚴缺乏完整角質層使得故血清中抗多含有囊型包蟲病，B超和影像檢驗出的鈣化的囊型或灶型包蟲病多分布于肝、肺2臟，血清學檢驗方法不易檢出的原因，通常為包蟲囊腫生長受到抑制后出現退行性改變，減少了血清抗體滴度導致血清學方法難以發現特異性抗體[1]。此外，還需看到本次檢測結果中還存在肝臟、肺臟的囊塊符合影像征象，但3種血清學檢查結果均不支持該結果，這也說明對包蟲病的診斷需綜合臨床和各類檢驗結果做出判斷。
本次探討可見囊型和泡型該2型包蟲病的致病性及診療方法各異，也導致了臨床需審慎做出判斷。在鈣化的灶型或囊型中若EM18-ELIB檢查為陽性則可考慮為泡型包蟲病，而單發單囊包蟲患者血清呈陽性則說明囊型包蟲也會分泌出EM18抗原，同時也說明種棘球絳蟲的生理生化代謝因種類不同其差異也不盡相同[2]。據盧愛桃，郭衛東，宋壯志，等報道[3]，目前通過將泡型包蟲的原頭節進行分離發現其具有EM2、EM2a和EM18特異性抗原，也說明泡型包蟲有特異性較強，與本文所探討的結果具有一致性。
綜上，通過采用不同血清學對包蟲病進行檢測，并對比各種檢查方法的檢測結果的敏感度和準確率，便于臨床分析各種檢測方法的效用，有助于臨床對包蟲病作出準確的診療判斷，進而可以起到積極預防控制包蟲病的流行的作用。
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關鍵詞：EB病毒；鼻咽癌；篩查；預測
1 EBV DNA與診斷
1998年泰國Mutirangura等發現鼻咽癌患者血清中可檢測出EBV DNA，且檢測的陽性率明顯高于正常人群[1]。馬來西亞Chai SJ等進行的一個多中心回顧性研究，對390例經病理確診而尚未治療鼻咽癌患者和41例健康對照人群及31例非惡性疾病患者采用定量PCR方法進行血漿EBV DNA 檢測發現，其陽性率分別為89.7% （350/390） ，12.2% （5/ 41）和6.5% （2/31）。中位濃度分別為6582 copies/ml （777-47，035 copies/ml），0 copies/ml和0 copies/ml，p
2 EBV DNA與分期、腫瘤體積
香港的Chan等發現血漿EBV DNA濃度與異基因移植裸鼠腫瘤質量成線性關系[3]，香港的Edward等對21例局部/區域復發或殘留的鼻咽癌患者進行手術治療，手術前中后檢測患者的血漿EBV DNA濃度的檢測發現，術后患者EBV DNA濃度明顯下降[4]。Lo等對10例鼻咽癌患者血漿EBV DNA水平作每天檢測發現，所有患者血漿EBV DNA在最初治療的1w內均出現一過性升高，這種現象與治療誘導癌細胞死亡釋放EBV DNA入血一致。以上均提示了血漿中的EBV DNA來源于原發腫瘤組織中，血漿中的EBV DNA是由鼻咽癌組織中釋放入血，因此血漿中EBV DNA的濃度可能反映原發腫瘤的大小。
Chai等觀察到早期患者（Ⅰ、Ⅱ期）和中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）中位EBV DNA拷貝數分別為2780 copies/ml 和10150 copies/ml。在161例IV期患者中，有遠處轉移的患者（M1）中位EBV DNA拷貝數為無遠處轉移的患者9.3倍，（199072 copies/ml 對 21411 copies/ml）[5]，提示血漿EBV-DNA 拷貝數及陽性率與鼻咽癌患者的臨床T分期均呈正相關關系。
3 EBV DNA與療效、預后預測
多個研究發現治療前EBV DNA水平的高低有重要的療效評價、及預后預測的作用， Lueng等長期隨訪376例鼻咽癌患者，多因素分析證實EBV DNA濃度總生存的獨立預后因素，研究觀察Ⅱ期與Ⅲ期，Ⅲ期與Ⅳ期生存率差異有統計學意義。亞組分析根據EBV DNA水平高低Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期患者分成高危組（>4000copies/ml）和低危組（4000copies/ml），結果顯示Ⅰ、Ⅱ期低危組5年生存率（91%）與Ⅰ期患者（92%）相似，而Ⅰ、Ⅱ期高危組5年生存率（64%）類似于Ⅲ期患者（73%），在Ⅲ和Ⅳ期患者中，高水平EBV DNA仍然為不良的預后因素，但總生存率未能與總分期有明顯區別。
然而，也有文獻報導，血漿EBV DNA清除率，或治療后EBV DNA水平更能有效判斷預后。香港Ngan等對19例復發轉移患者進行化學治療，觀察到62%患者在臨床復發前17.4w（8～74.5w）已檢測到血漿EBV DNA，有遠處轉移的患者血漿EBV DNA濃度高于局部/區域復發者，挽救性化療后血漿EBV DNA早期下降至基線水平者療效好，提示血漿EBV DNA清除率在預測化療效果中有重要作用。
4討論與思考
對于復發轉移鼻咽癌，血漿EBV DNA清除率、治療后EBV DNA濃度反映化療療效，能早期判斷化療療效，及時發現無效的化療方案，盡早更換，為晚期鼻咽癌患者爭取寶貴的治療機會。血漿EBV DNA檢測作為鼻咽癌一種無創、成本效益高且準確預測預后的方法，將在我們的臨床實踐中起著重要的影響。
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[關鍵詞] 乙型肝炎病毒;DNA;ELISA
[中圖分類號] R512.6+2[文獻標識碼] B[文章編號] 1673-7210(2010)06(b)-064-02
The relationship between quantitative detection of HBV-DNA and its serological markers
PENG Jiliang1, WEN Xiuming1, XU Ruihuan2, SHEN Cishi1, HE Chunhui1
(1.Shenzhen Longgang Blood Station, Shenzhen 518172, China; 2. Longgang Central Hospital of Shenzhen City, Shenzhen 518116, China)
[Abstract] Objective: To study the HBV-DNA positive rates under its different serological groups. Methods: 324 HBV serum were detected by ELISA and quatitative PCR technique. Results: The HBV-DNA positive rate was 78.4% (254/324) in HBsAg positive group,and 4.8% (5/103) for HBsAg negative group, the differences between the two groups were statistically significant (P
[Key words] Hepatitis B virus; Deoxyribonucleic acid; Ensyme linked immunosorbent assay
近年來隨著分子生物學技術的發展及其在臨床應用方面的推廣,應用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測 HBV 病毒載量已成為目前臨床診斷 HBV 感染的常用指標,進一步提高了檢測的質量。同時采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測乙型肝炎病毒HBV標志(HBV-M)簡便易行,一直為許多臨床科室使用。臨床上有必要把此兩種方法的檢測結果聯合起來進行分析,指導臨床應用。
1 材料與方法
1.1 研究對象
2009年6～9月來我院住院及門診的423例患者,年齡13～66歲。所有標本用無菌管留取血樣3 ml,于3 h內分離血清,并凍存于20℃冰箱。
1.2 主要試劑
HBV-DNA定量診斷試劑由深圳市匹基生物技術公司提供。HBV-M測定用酶聯免疫吸附試驗(ELISA),試劑由上海科華生物工程公司提供。
1.3 檢測方法
1.3.1 ELISA法按試劑說明書進行。
1.3.2 熒光定量PCR法檢測HBV-DNA①樣本處理,取待測血清或血漿樣本以及試劑及試劑盒中的對照各100 μl,分別加到0.5 ml離心管中,100 μl DNA提取液1,振蕩混勻,13 000 r/min離心10 s,25 μl DNA提取液2,振蕩10 s,200 r/min離心10 s,100℃干浴或沸水浴10 s,13 000 r/min離心10 s,保留上清備用。②反應體系為40 μl:37.6 μl PCR反應液、0.4 μl Taq酶、0.06 μl VNG及2 μl提取物。③循環條件為:37℃ 5 min、94℃ 1 min、95℃ 5 s,60℃ 30 s 42個循環。熒光信號收集在60℃。
1.3.3 污染的控制標本的處理、試劑的配制、上樣及PCR擴增檢測嚴格分室進行,每次檢測均設強陽性、臨界陽性、陰性、質控試劑參照品。
1.4 檢測儀器
美國ABI公司生產的ABI7500熒光定量PCR儀,芬蘭Labsystems生產的Multiskan MK 3酶標儀。
1.5 統計學方法
對所得數據進行χ2檢驗。P
2 結果
2.1 HBsAg(+)組與HBsAg(-)組HBV-DNA陽性率的比較
324例血清標本HBV-DNA表達情況見表1。
表1 HBsAg(+)組與HBsAg(-)組HBV-DNA陽性率的比較(%)
Tab.1 The comparasion of HBV-DNA between HBsAg(+)group and HBsAg(-)group (%)
由表1可見,HBsAg(+)組HBV-DNA陽性率為78.4%,有21.6%的陰性率。HBsAg(-)組HBV-DNA陰性率為95.1%,有4.8%的陽性率,組間差異有統計學意義(P
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2.2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結果
324例血清標本HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結果見表2。
表2 HBV-M不同模式的HBV-DNA檢測結果
Tab.2 The results of HBV-DNA under HBV different serological makers
由表2可見血清HBsAg HBeAg HBcAb陽性組合HBV-DNA陽性率為100.0%,拷貝數達到1.61×107拷貝/ml。HBsAg、HBcAb、HBsAg HBeAb HBcAb、HBsAb、HBeAb、HBcAb陽性率依次降低。
3 討論
酶聯免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒已成為臨床常規。乙肝五項的檢測為臨床提供一定的信息[1-3],但對HBsAg陰性者,本實驗發現有5%的 HBV-DNA陽性,且拷貝數在104拷貝/ml 左右,與某些文獻報道相似[4-5]。其原因可能由于:①HBV發生變異,其前S區變異率比S區高2倍;前C/C區變異研究較多。②HbsAg的表達可能較低或其抗原性改變較大,用現有的試劑檢測不出。③形成免疫復合物,有人發現血中免疫復合物的存在可能影響HbsAg的檢出[6]。
乙型肝炎病毒DNA拷貝數可真實反映HBV感染的狀況[7-9],本試驗結果為HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA全部陽性,平均含量為1.61×107拷貝/ml; HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA陽性率為47.0%,平均含量為3.42×104拷貝/ml;HBsAg(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA陽性率為69.0%,平均含量為6.32×104拷貝/ml,而HBsAb(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的患者血清,HBV-DNA陽性率為5.2%,平均拷貝數為4.12×104拷貝/ml,由此可以看出血清中乙型肝炎病毒DNA拷貝數與其血清學指標組合是相匹配的,對乙型肝炎的臨床診斷,特別是對其療效有較大的指導意義[10-11]。本實驗發現HBsAg(+)HBcAb(+)的陽性率為69.0%,比HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)的陽性率(47.0%)高,且差異有統計學意義(P
本實驗所用的BIO-RADicycler熒光定量PCR技術靈敏度高,操作簡單,克服假陽性結果,無需PCR后處理,防污染效果好,可直接反映病毒在體內的存在情況,已為臨床普遍應用。血清學ELISA方法是檢測病毒侵染機體產生的免疫反應,間接反應病毒的感染狀況。對于 HBeAg 與 HBV 病毒載量之間的關系,一般認為兩者的水平存在一定程度的一致性。本試驗顯示兩者既有相關,又不盡一致,臨床上需要將兩者結合起來對患者進行診斷和治療。
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關鍵詞：乙肝兩對半（HBVM）；HBVDNA
【中圖分類號】R156.3【文獻標識碼】A【文章編號】1674-7526（2012）06-0349-02
乙型病毒性肝炎，簡稱乙肝，是一種由乙型肝炎病毒（HBV）感染機體后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一種嗜肝病毒，主要存在于肝細胞內并損害肝細胞，引起肝細胞炎癥、壞死、纖維化。乙型病毒性肝炎分急性和慢性兩種[1]。我國目前乙肝病毒攜帶率為7.18%，其中約三分之一有反復肝損害，表現為活動性的乙型肝炎或者肝硬化。隨著乙肝疫苗的推廣應用，我國乙肝病毒感染率逐年下降，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率僅為0.96%。HBV-DNA意思是乙肝病毒脫氧核糖核酸。乙肝病毒是一種部分雙鏈DNA病毒，也就是說它的遺傳物質是DNA，它載有病毒所有遺傳信息，乙肝病毒靠它才可以復制、增殖、繁衍后代。經研究證實，乙肝病毒的裸DNA（沒有蛋白質包裹DNA）就有感染性，完成對宿主的侵襲，造成宿主體內出現完整的乙肝病毒顆粒。也就是說HBV-DNA檢測相當于完整的乙肝病毒顆粒。因此，HBV-DNA檢測是判定乙肝病毒有無復制的金指標。本次研究為了更好的了解乙肝兩對半和HBVDNA兩者之間的聯系，選擇從2008年1月到2009年1月期間就診的患者的320份血清。并將這320份血清隨機分為兩組，觀察組和對照組，觀察組使用ELISA方法檢測乙型肝炎兩對半（HBVM），用PCR方法檢測HBVDNA。對照組的HBVDNA和乙型肝炎兩對半（HBVM）都采用ELISA法檢測并分析[1]。將兩種效果進行分析和比較，并將這些資料進行分析研究。現將研究成果報告如下。
1資料與方法
1.1一般資料：選擇從2008年1月到2009年1月期間就診的患者的320份血清。并將這320份血清隨機分為兩組，觀察組和對照組，觀察組使用ELISA方法檢測乙型肝炎兩對半（HBVM），用PCR方法檢測HBVDNA。對照組的HBVDNA和乙型肝炎兩對半（HBVM）都采用ELISA法檢測并分析。
1.2.1檢測方法：用ELISA方法檢測HBsAg，抗HBc，抗HBs，HBeAg，抗Hbe，用PCR方法檢測HBVDNA，各個操作方法和結果的判定按照說明書進行。
1.2.2統計學方法：統計學處理的所有數據均按照SPSS110的軟件進行過處理。差異有統計學意義。P
2結果
觀察組中就診的患者的320份血清樣品HBVM和HBVDNA檢測結果比較，見表1。
2.2用PCR是檢測HBVDNA含量較為精準的方法，能夠正確反映乙肝病毒的復制水平和活躍程度。
[關鍵詞]核酸檢測；血液篩查；輸血風險；血液安全；轉錄介導擴增技術
輸血相關傳染病的預防和控制是全社會關注的焦點之一。2010年，國家衛生與計劃生育委員會（原衛生部）確定在全國15家采供血機構開展核酸檢測（NAT）試點工作，以進一步保證血液檢測質量，提升我國無償獻血者血液檢測水平。到目前NAT技術已經廣泛運用于全國各地血站的血液篩檢。該技術的檢測靈敏度較ELISA檢測方法高，能顯著縮短病原體檢測的窗口期，從而降低輸血傳播病毒的殘余風險50%以上。但NAT技術從理論上并不能完全消除“窗口期”，國外已有經核酸檢測后仍發生輸血后感染的病例報道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式將NAT技術應用于血液篩查項目中，對全部無償獻血者血液標本進行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸檢測。本研究通過對無償獻血者血液標本的常規血清學及核酸檢測結果的分析，以評估核酸檢測的檢測功效，以及本地獻血者人群的感染狀況。現將檢測結果報道如下。
1資料與方法
1.1一般資料
2011年1月～2014年12月，廣州血液中心采集的無償獻血者血液標本1146740例。所有無償獻血者均符合現行的衛生部《獻血者健康檢查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同時留取核酸檢測標本和酶免檢測標本管各一支。核酸檢測標本采集、保存和處理等均嚴格按照衛生部核酸檢測試點技術要求操作。
1.2主要儀器與試劑
核酸檢測儀器：Grifols公司（原諾華診斷公司）PROCLEIX TIGRIS全自動核酸檢測分析系統，試劑配置恒溫箱（RPI）。試劑為PROCLEIXULTRIO Assay核酸聯檢試劑盒和核酸鑒別試劑盒（Discriminatory Assay）。核酸檢測試劑批號：（593226，614952，624775，116153等）。血清學檢測儀器：STAR全自動加樣儀和全自動酶聯免疫分析儀（FAME24/30）。ELISA檢測主要試劑包括乙肝表面抗原試劑盒（法國梅里埃，批號B11FA，20110704；上海科華：批號201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗體試劑盒（美國強生ORTHO：批號EXE187，EXE208；上海科華：批號201103011，201202031，201303011）及人類免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗體檢測試劑盒（法國伯樂，批號1F0189，280213，3F0259；北京萬泰，批號1201 10204，120121 120，12013 1022）。
1.3檢測策略
血液標本采用血清學和NAT并行檢測操作策略；對核酸檢測單獨反應性標本進行分項鑒別試驗。
1.4檢測方法
采用PROCLEIX TIGRIS 全自動核酸檢測分析系統（TMA方法）對血液核酸標本進行單人份聯合檢測（HIV-1/HCV/HBV）；對核酸檢測單獨反應性標本進行分項鑒別試驗；核酸檢測結果反應性結果由檢測系統軟件自動判定，其判定標準為樣本的S/CO值≥1。采用兩種不同廠家的ELISA試劑對獻血者標本進行血清學HBsAg、HCVAb、HIVAgAb檢測，嚴格執行說明書進行相關操作，通過陰陽性對照及室內質控品來控制試劑盒的質量和檢測的有效性；血清學檢測結果陽性的判定：樣本OD≥cut off值。
1.5檢測原理
Grifols核酸檢測試劑是以轉錄介導的擴增（transcription-mediated amplification，TMA）技術原理來檢測病毒核酸的方法。其檢測基本原理是：利用特異性的目標捕獲試劑和磁微珠分離純化被檢測病毒核酸分子，再通過TMA技術來擴增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片斷，最后通過雜交保護（HPA）方法檢測擴增產物。試劑中含有內標分子，用以監測整個反應過程，避免出現假陰性結果。
1.6統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行處理和分析，對計數資料進行x2檢驗，P
2結果
2.1血清學與核酸檢測結果的比較
對1 146 740例獻血者血液標本，核酸檢測的陽性檢出率為0.97%，低于血清學（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三項之和）的檢測陽性率1.66%，二者之間的差異具有統計學意義（x2=2128.4，P
2.2核酸檢測
4年中Grifols單人份核酸檢測系統的總陽性率為0.97%，并且陽性率呈現逐年緩慢增加的趨勢。在對每年的檢測陽性率進行比較時，各年度間檢測陽性率未見統計學意義（x2=2.442，P
2.3血清學合格標本中核酸檢測情況
在1114428例血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢出2457例核酸反應性樣本，核酸單獨反應性比率為0.22%；在對每年檢測陽性率進行比較時，各年度間血清學檢測合格標本其NAT檢測陽性率之間的差異具有統計學意義（x2=16.506，P
2.4核酸鑒別結果
在2457例核酸單獨反應性標本中，鑒別試驗反應性的樣本為718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染，HBV DNA鑒別陽性率與另外兩者間的差異具有統計學意義（x2=2091.464，P
3討論
目前，國內外應用于血液篩查的核酸檢測技術主要有TMA及PCR兩種。我中心使用的是Grills公司基于TMA技術的核酸檢測試劑，對全部獻血者樣本進行單人份核酸檢測。這種檢測方法的靈敏度高，反應條件簡單，擴增效率高，可以防止低拷貝的病毒陽性血液的漏檢。其分析靈敏度為：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且該方法的整個反應過程在1個試管中進行，因此也減少了污染發生的可能。本研究顯示，廣州地區無償獻血者血液標本的核酸陽性檢出率明顯低于酶免檢測項目陽性檢出率（P
在獻血者血液篩查中引入核酸檢測技術，其主要目的是檢測出原有血清學檢測可能漏掉的具有感染性的獻血者樣本。在本研究中的1114428份血清學檢測合格標本中，單人份核酸檢測共檢測出反應性樣本2475例，陽性檢出率為0.22%（2457/1114428），結果明顯高于大連和沈陽地區0.07%，這可能與各地區病毒流行率差異、檢測樣本數量、使用試劑差異，以及檢測模式（單人份與多人份混樣檢測）不同有關。在對這些核酸單獨陽性樣本的鑒別檢測中，共檢出718例陽性結果，鑒別陽性檢出率為29.22%。這個鑒別率與汪德海等報道的一致，而低于大連，杭州等地的數據。而出現核酸檢測聯檢反應性，而鑒別試驗全部為非反應性的原因可能有：（1）聯檢結果假陽性。這可能是由于酶免及核酸檢測平行進行，檢測人員若操作不規范，導致陽性標本的小范圍污染，增加聯檢結果假陽性的可能；或由于檢測試劑本身的非特異性反應。（2）鑒別試驗的假陰性。如病毒濃度處于極低的濃度水平，由于病毒顆粒在血漿中的泊松分布，導致取樣時未能吸取到帶有病毒的樣本；或可能是因不合適的儲存條件，不良的運送，干擾物質的存在，導致樣本中病毒的降解，也會造成鑒別試驗假陰性的結果。由于我國乙肝的流行率相對較高，因此獻血者中核酸單獨陽性的樣本大多屬于HBV感染。而HBV感染，特別是隱匿性乙肝感染（OBI）的病毒濃度通常很低，因此出現上述低濃度樣本的可能性很大。已有文章報道，對于不可鑒別的樣本，采用其他核酸檢測方法，或乙肝感染標志物（如乙肝核心抗體）進行檢測時，部分樣本仍然呈現陽性結果。提示這些不可鑒別的樣本中存在一定比例的真陽性。
【關鍵詞】梅毒;檢測方法;臨床意義
【中圖分類號】R994.1【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)10-181-2
梅毒(Syphilis)是一種慢性接觸性傳染病。梅毒的病原體是蒼白螺旋體(Treponema pallidum),是一種對人有嚴重致病性的螺旋體,能侵犯任何器官,產生各種癥狀。梅毒螺旋體只感染人類,故梅毒是唯一的傳染源[1]。其傳染途徑,后天性梅毒主要通過傳染,少數可通過接吻傳染,也偶有通過胎盤傳給胎兒而致病。得不到治療的梅毒患者,在感染后一年內,其傳染性最大,病期越長,傳染性越小。感染四年后,通過性接觸一般已無傳染性,但仍可胎傳[2]。本研究選用常用的RPR和TPPA2種方法同時對87例早期梅毒血清進行檢測,比較梅毒檢測實驗方法的靈敏度和特異性。
1材料和方法
1.1一般資料:本組資料根據經我院皮膚性病科自2006年7月-2009年2月收治的65例確診患者,其中男性患者42例,占64.62%,女性患者23例。最小年齡21d,最大年齡53歲,平均年齡為32±4.2歲。I期梅毒29例,Ⅱ期梅毒22例,III期梅毒10,潛伏梅毒4例。病程:最短1d,最長3個月,其中梅毒硬下疳潰破1～4d者7例,5～10d者20例,>10d者27例。
1.2試劑:TPPA試劑盒(富士瑞必株式會社日本東京);RPR試劑盒(上海榮盛生物有限工司)。
1.3方法:取患者血清,采用TPPA利用純化的致病性梅毒螺旋體(Nmhol株)SEBODIA抗原包被明膠顆粒和RPR兩種試驗方法進行對比檢測分析。試驗操作參照試劑盒內說明書進行。
2結果
本組65例被測患者結果顯示,3l例兩種方法都為陽性,22例TPPA為陽性;2例RPR為陽性。見表l、2。
表1 兩種方法檢測梅毒患者血清的陽性結果;
試驗方法 檢測例數陽性 陰性
RPR 6537(56.92%) 28(43.08%)
TPPA 6559(90.77%)6(9.23%)
表2 梅毒患者的RPR、TPPA試驗的陽性檢出率和病程之間關系;
破潰時間例數RPR陽性TPPA陽性
1-4d 72(28.57%)5(71.43%)
5-7d 20 8(40%)12(60%)
10d2727(100%) 27(100%)
3討論
梅毒是由蒼白螺旋體引起的一種性傳播疾病,潛伏早期的梅毒患者也有傳染性[3]。這種病原體通過粘膜或有破損的皮膚進入人體后,經淋巴系統及血液循環播散到全身,幾乎可以侵犯全身各臟器和組織,呈現出多種多樣的臨床表現,病程中有時呈無癥狀的潛伏狀態。梅毒的主要是傳播途徑是性接觸,有些人可以通過胎盤垂直傳播,但接吻、帶菌的毛巾、剃刀、餐具、輸血等等也可以傳播梅毒[4]。本病分3期:①一期梅毒。即硬下疳,潛伏期2～4周,外生殖器部位發生暗紅色硬腫塊、淺潰瘍,有軟骨樣硬度,周圍淋巴結腫大。②二期梅毒。在一期梅毒1～2個月之后,全身皮膚、粘膜發生對稱泛發皮疹、斑疹、丘疹、膿皰疹等。粘膜可發生粘膜斑、扁平濕疣,傳染性強。③三期梅毒。發生在感染后2～3年乃至10年,皮膚為樹膠樣腫,還可涉及骨、關節、心、血管,表現為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等,侵及神經為脊髓癆,全身麻痹(麻痹性癡呆)。先天梅毒有早期先天梅毒,相當于后天二期,但較重。晚期先天梅毒與后天相似,但很少發生心、血管及神經病變。主要為實質性角膜炎、神經性耳聾、哈欽森氏齒(上門齒中央切痕,下小上大,寬厚相等)、佩刀形脛骨等。各期之間可有潛伏梅毒,無癥狀,僅血清反應陽性。治療使用青霉素或紅霉素、四環素等[5]。
梅毒是一種全身性慢性傳染病,梅毒、結核、麻風并列為世界三大慢性傳染病[6]。梅毒的病原體是一種螺旋體,梅毒螺旋體是一種小而纖細的呈螺旋狀的微生物,長度為5―20nm,直徑
梅毒螺旋體進入人體4～6周,血清中可產生抗類脂抗原的非特異性抗體和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體。根據梅毒螺旋體進入人體后產生兩種抗體的特征將血清血試驗分為兩大類[8]。
非梅毒螺旋體抗原血清學試驗,目前最常用的具有代表性的方法為RPR,適用于梅毒篩查、療效觀察、復發或再感染的檢查。梅毒螺旋體抗原血清學試驗:①梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)。目前最具有代表性。可作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初篩陽性標本的確證試驗。梅毒患者經過抗梅治療后,不能作為療效觀察的指標。不能區分既往感染和現癥感染,應結合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結果進行診斷[9]。
通過臨床我們認為非梅毒螺旋體試驗陽性可能表示:①現癥感染;②復發或再感染;③生物學假陽性。梅毒螺旋
(下轉第184頁)
(上接第181頁)
體抗原血清學試驗陽性可能表示:①現癥感染;②既往感染;③感染了梅毒,梅毒螺旋體抗體終生陽性,不能作為治療效果的指標[10]。
所以,為了排除非梅毒螺旋體試驗的生物學假陽性結果,為了確認非梅毒螺旋體試驗的陽性結果,所有的非梅毒螺旋體試驗陽性標本必須用特異性梅毒螺旋體試驗進行確證。非梅毒螺旋體血清試驗一般來說靈敏度較高,但特異性較差,假陽性的機會較多,因此主要用于大量人群中進行篩選[11].梅毒螺旋體血清學試驗的特異性及靈敏的均比非梅毒螺旋體血清學試驗為高,但由于方法較為復雜、費時,一般只用于證實診斷。另外,梅毒臨床診斷除了實驗室檢查還應結合相關依據:如(1)病史:包括不潔性接觸史、配偶健康情況、本人過去有無性病的臨床表現及患性病回購的治療情況.懷疑胎傳梅毒時,應詢問其母親婚姻、妊娠、分娩情況,兄弟姐妹的健康情況,以及患者有無早發和晚發胎傳梅毒的臨床表現[12].
梅毒血清學檢查對于診斷二期、三期梅毒,以及判定梅毒的發展和痊愈,判斷藥物的療效都有十分重要的意義。梅毒血清學檢查包括非梅毒螺旋體血清學試驗和梅毒螺旋體血清學試驗。前者常用于臨床篩選及判定治療的效果,抽血后1小時即可出結果,費用也低廉。后者主要是用于判定試驗,但是它不能判定治療效果,一旦患有梅毒,這一試驗將終身陽性。快速血漿反應素環狀卡片試驗(RPR)。可用作臨床篩選,并可作定量,用于療效觀察。
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【關鍵詞】 梅毒螺旋體抗體；梅毒螺旋體酶聯免疫吸附試驗；梅毒螺旋體抗體凝集法
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.13.023
梅毒在《中華人民共和國傳染病防治法》中列為乙類防治管理病種， 其是一種慢性、系統性性傳播疾病[1]， 由蒼白螺旋體蒼白亞種（TP）感染所引起。其主要通過性傳播途徑、血液、母嬰垂直傳播途徑等傳播。隨著醫學和科技的不斷發展， 各種有效的抗菌藥物可積極控制梅毒的發展， 但梅毒發病率仍居高不下， 且梅毒感染還可增加患艾滋病的風險[2]。梅毒根據臨床表現可分為一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潛伏梅毒和胎傳梅毒等。各期梅毒的臨床特征分別為一期梅毒的硬下疳， 通常感染TP后7～60 d 出現；二期梅毒以二期梅毒疹可伴有全身癥狀；三期梅毒（晚期梅毒）中， 1/6為良性， 1/6～1/5為嚴重的晚期梅毒可有皮膚黏膜潰瘍性損害或內臟器官的肉芽腫樣病變， 近關節結節、心血管毒素、神經梅毒等表現[3]， 對自身組織器官的破壞性很強；潛伏梅毒（隱形梅毒）無明顯臨床癥狀， 腦脊液檢查正常但梅毒血清試驗陽性， 顯性梅毒活動期后癥狀暫時消退后也可引起；孕期發生的顯性或隱性梅毒叫妊娠梅毒， 此時， TP可通過胎盤或臍靜脈傳給胎兒讓所生嬰兒患先天梅毒， 梅毒孕婦極易造成流產、早產、死胎， 只有少數可生健康兒。據WHO估計梅毒在全世界流行， 每年約有1200萬新發病例， 主要集中在南亞、東南亞和次撒哈拉非洲。我國近年來梅毒已成為報告病例數最多的性病， 因此采用高敏感性和高特異性的檢驗方法對于該病的確診和治療具有重要意義。本文采用TP-ELISA法和TPPA法兩種方法對490份血清標本進行檢測比較， 現報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選擇2015年1月～2016年7月在本院做TPPA的標本490例， 其中臨床確認梅毒標本40例， 批量做TP-ELISA檢測。
1. 2 試劑和方法 TP-ELISA和TPPA檢測試劑盒分別購自珠海麗珠試劑公司和日本富士瑞必歐。兩種檢測都嚴格按照檢測試劑盒說明書進行操作。采用瑞士的HAMEITONG為TP-ELISA的洗板和判讀。TP-ELISA每次測試均設置空白、陰性和陽性對照， 與待測標本同時檢測。TPPA每次測試均設置陰性、陽性對照， 與待測標本同時檢測， 肉眼判讀。
1. 3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P
2 結果
2. 1 檢測梅毒螺旋體抗體的陽性率 采用TP-ELISA和TPPA從上述血清中檢出TP陽性有41例和40例， 陽性檢出率分別為8.4%和8.2%， TP-ELISA的假陽性率為0.2%， 兩種方法陽性檢出率比較， 差異無統計學意義（P>0.05）。
2. 2 TP-ELISA和TPPA檢測的一致性 兩種方法陽性符合率為97.6%（40/41）， 陰性符合率為99.8%（449/450）， 總符合率為99.8%（489/490）， TP-ELISA陽性TPPA陰性有1例。見表1。
3 討論
血清學試驗在梅毒的診斷中具有重要意義。當人體感染梅毒螺旋體后1個月后， 抗類脂質抗原的非特異性反應素抗體[主要免疫球蛋白（Ig）M和IgG]和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體（主要是IgG、IgM）可在血清中產生， 可通過各種免疫學方法檢測此兩種抗體作為協助診斷梅毒。實驗室梅毒血清學診斷的方法很多， 選取符合患者利益的靈敏度高、特異度強檢查方法顯得尤為重要。針對非螺旋體抗原（心磷脂抗原）的快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）、 梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等檢測方法， 可做定量試驗， 用于判斷療效和病情活動程度；而針對梅毒螺旋體特異性抗原的TPPA、TP-ELISA等檢測方法， 特異度高， 用于TP 感染的確證[4]。另外梅毒螺旋體IgM 抗體檢測診斷嬰兒的胎傳梅毒意義很大。TP-ELISA是以梅毒螺旋體抗原包被， 以雙抗原夾心同時檢測IgG、IgM抗體， 由于TP-ELISA法利用了酶的放大系統， 提高了檢測靈敏度[5]， TP-ELISA操作簡便快捷， 易實現大批量自動化處理， 非常適合用于大批量的血清梅毒篩查工作。高齡老人[6]血清中的特殊成分和臨床上許多疾病如自身免疫性疾病、惡性腫瘤、糖尿病等可使患者體內含有某些治療性抗體、易嗜性抗體、類風濕因子、甲胎蛋白等， 這些特殊成分有一定的吸附作用， 讓 TP-ELISA血清學試驗有一定的假陽性率， 本文中前面分析的TP-ELISA法陽性而TPPA法陰性的1例結果， 可能是上述原因造成的。TPPA 試驗是目前國際上公認的檢測梅毒確診的首選方法， 其檢測血清中的梅毒特異性抗體是利用人工載體明膠粒子包被純化后的梅毒螺旋體菌株成分制成抗原， 其特異度和靈敏度均較高， 但其試劑價格昂貴， 檢測時需手工將標本做系列稀釋， 自動化程度低， 以肉眼判斷結果， 主觀性較強， 不利于大批量標本檢測[7-9]。本文結果中TPPA法靈敏度高特異性好， 不易出現假陽性反應[10]， 本文中TPPA法未出現假陽性結果。由于梅毒特異性抗體IgG出現較晚， 甚至可終身存在， 而心磷脂抗體可在梅毒治愈后消失， 所以TP-ELISA或TPPA陽性也無法判斷是初次感染還是既往感染， 即在確認梅毒后， 用TRUST法來判斷傳染性和治療療效比較適宜。總之不同的梅毒檢測方法聯合檢測， 可進一步提高梅毒檢測的敏感性和特異性[11-14]。
綜上所述， 為實現大批量自動化處理和提高檢測的準確性， 對于梅毒檢驗工作使用TP-ELISA篩查聯合TPPA確認更為快速， 準確。
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【關鍵詞】 Rh血型 DEL表型; RHD 1227A等位基因; 基因分型
[Abstract] Objective: To establish a genotyping method for DEL phenotype of human blood group system.Methods： The genotype was determined by using genotyping method of RH Box， and DEL phenotype was determined by serological method. An allelespecific polymerase chain reaction(ASPCR) was designed for genotyping of DEL phenotype according to the sequence of the allele of RHD 1227A. The results achieved by the ASPCR method were compared with those by serological method， the feasibility of the genotyping method in clinical practices was evaluated. Results： Twentyeight RHD-/RHD- samples were negative by serological method and genotyping method for DEL phenotype. In 25 RHD+/RHD- and RHD+/RHD+ samples， 11 DEL phenotype positive samples were positive by ASPCR method. However， one DEL phenotype negative sample was positive by ASPCR method for DEL genotype. This sample was determined positive by sequencing analysis. Genotyping method for DEL phenotype had higher sensitivity than serological method. Conclusion： The ASPCR method can be used for screening DEL phenotype among the population negative of RHD antigen.
[Key words] Rh blood group DEL phenotype; RHD 1227A allele; genotyping
Rh血型系統中D抗原在輸血醫學中意義重大，重要性僅次于ABO血型系統。有研究表明黃種人和白種人個體RHD基因結構不完全相同。在黃種人中一些RhD(-)個體用吸收放散的方法仍能檢測到D抗原，稱之為D洗脫陽性(DEL)[1]。這種血液輸給RhD陰性患者仍會產生D免疫反應[2]，因此對DEL抗原的免疫原性應予以重視。目前臨床上DEL血型的檢測常用吸收放散方法，由于試驗步驟繁瑣而不適用于臨床大規模應用。因此如何快速有效地鑒定DEL表型已成為一個具有重要臨床意義的課題。近年來研究發現，中國漢族人群DEL表型和RHD 1227A等位基因相關[3]。本研究根據RHD 1227A等位基因相序列，通過等位基因特異性PCR技術(allelespecific PCR，ASPCR)，建立了DEL表型基因分型的檢測方法，能有效地檢測DEL表型，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
至本中心血站獻血的無親緣關系的Rh陰性漢族獻血者和至本站行產前檢測的Rh陰性孕婦標本。
1.2 血型血清學試驗
按衛生部《中國輸血技術操作規程》進行紅細胞RhD，C，c，E，e抗原的檢測。間接抗球蛋白試驗排除血樣中的弱D和不完全D表型。IAT確認采用上海血液中心提供單克隆IgG抗D(clone:BS226，Bs232)，DIAGAST的單克隆IgG/IgM抗D(clone:P3×61+P3×21223B10+P3×290+P3×35)以及DBL NOVACLONE的單克隆IgG/IgM抗D(clone:4151E4+1752)。剩余血樣通過吸收放散試驗篩選DEL表型[4]。
1.3 DNA提取
抽取外周血5 ml，EDTANa2抗凝，采用試劑盒提取全血DNA(EZBDC血液基因組DNA快提試劑盒，濟南泰天和生物科技有限公司)，分裝-80℃保存備用。
1.4 RHD基因分型
采用RH Box基因分型試劑盒(G&T，美國)PCR反應總體積9 μl，含7 μl PCR引物混合液，1 μl DNA樣品，1 μl Taq酶(含0.33～0.5單位)。PCR擴增條件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環后置72℃再延長5 min。使用0.5×TBE緩沖液，配制2%瓊脂糖凝膠，以10 V/cm電泳30 min，結果通過凝膠成像儀(FR200A全自動紫外與可見分析裝置，上海復日科技)拍照成像。
1.5 RHD 1227A基因分型
采用吳俊杰等[5]的方法根據RHD基因和RHD 1227A等位基因相關序列設計一組特異性擴增RHD 1227A等位基因的引物(上海生工生物技術公司合成)。RHDels:5′GACCAAGTTTTCTGGAAA3′(位置對應于AJ299028的6885)，RHDela:5′CGAGAGAATTTTGAGCAC3′( 位置對應于AB035185的849832)。一對特異擴增人GAPDH基因240 bp的引物作為內對照，GAPDHF:5′TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3′，GAPDHR:5′TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT3′。總反應體積為10 μl，含模板DNA 0.2 μl，特異性引物終濃度250 nmol/L，內對照引物終濃度50 nmol/L，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，dNTP終濃度200 μmol/L，Taq酶0.2 U。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，30個循環后72℃再延長5 min。使用0.5×TBE緩沖液，配制2%瓊脂糖凝膠，以10 V/cm電泳30 min，結果通過凝膠成像儀拍照成像。
2 結 果
2.1 Rh表型確定
通過凝集試驗和抗人球蛋白試驗，篩選Rh陰性標本。血清學確定53例Rh陰性標本，其中ccdee 10例，帶有RhC抗原的43例。
2.2 PCR檢測RHD基因
用美國G&T公司的RH Box基因分型試劑盒檢測標本融合盒子(Hybird Rhesus Box)和下游盒子(Dwon Rhesus Box)。只帶有融合盒子的為RHD基因完全缺失(RHD-/RHD-)，只帶有下游盒子的為有2條染色體帶有RHD基因(RHD+/RHD+)，同時出現融合盒子和下游盒子的為一條染色體帶有RHD基因(RHD+/RHD-)，結果見圖1。在10例表型為ccdee的標本中，RH Box基因分型都為RHD-/RHD-，在43例RhC陽性的RhD陰性標本中，檢出18例RHD-/RHD-型，10例RHD+/RHD-型，15例RHD+/RHD+型。
1：RHD-/RHD-純合子只顯示下游盒子和融合盒子1508 bp條帶;2，3：RHD+/RHD-雜合子，同時出現下游盒子和融合盒子1508 bp條帶;M：DL2000標準參照物。內對照為429 bp
2.3 DEL表型的檢測
在10例表型為ccdee的標本中，用血清學方法和基因分型的方法都未檢測到DEL表型。在43例RhC陽性的RhD陰性標本中，18例未檢測RHD基因的標本用血清學方法和基因分型的方法均未檢測到DEL表型。在25例攜帶一條或兩條RHD基因的RhD陰性標本中，用血清學方法檢出11例DEL表型，這11例標本用基因分型方法均擴增到了867 bp的1227A等位基因條帶，基因檢測結果見圖2。在這25例標本中有1例標本為血清學陰性，基因分型方法陽性。由于標本為陳舊性標本，無法重新進行吸收放散試驗。由于吸收放散試驗操作繁雜，步驟較多，同時操作者的不同判定的結果也會出現差異，因此可能為血清學法的漏檢。后經上海生工生物技術公司對外顯子9序列分析，結果為RHD 1227A陽性。結果見表1表1 RH Box基因型與DEL表型檢測結果
3 討 論
中國是個多民族國家，RHD基因的遺傳背景十分復雜，DEL的遺傳背景在中國漢族人和歐洲白人之間存在明顯差異。根據近年來的研究結果表明，我國漢族人群DEL血型的分子基礎是RHD 1227A等位基因[6]。因此本研究根據RHD 1227A等位基因序列，用ASPCR方法進行了DEL表型基因分型的檢測。同時由于RHD基因的存在與RhC之間存在關聯[7]，而DEL型的RHD基因基本完整。因此我們重點選擇了RhC陽性表型的RhD陰性標本進行研究。
根據表1的結果，在28例RH Box基因分型RHD-/RHD-的標本中均未擴增到1227A等位基因，在25例攜帶一條或兩條RHD基因的RhD陰性標本中，用血清學方法檢出11例DEL表型，這11例標本用基因分型方法均擴增到了867 bp的1227A等位基因條帶。這說明基因分型方法檢測DEL表型和血清學方法相吻合。
在這25例標本中有1例標本為血清學陰性，基因分型方法陽性。由于標本為陳舊性標本，無法重新進行吸收放散試驗，后經上海生工生物技術公司對此標本的外顯子9序列分析，結果為RHD 1227A陽性。由于吸收放散試驗操作繁雜，步驟較多，同時操作者的不同判定結果也會出現差異，因此此例標本可能為血清學法的漏檢。這說明基因分型方法檢測DEL表型和血清學方法結果還是一致的，同時這也提示基因分型的方法在靈敏度上高于血清學的方法，還有更好的重復性。
基因分型的方法可以有效地檢測RHD 1227A等位基因，并且該方法有很高的靈敏度。因此對ccdee這些DEL表型陽性率比較低的標本可以通過檢測多份樣品的混合樣來提高工作效率。
在中國漢族人中RhD陰性人群占0.2%～0.5%，這些RhD陰性人群中有很高比例的DEL表型，有文獻報道中國漢族人中DEL表型占到RhD陰性人群的24.4%[8]。DEL雖然不表達正常的RhD蛋白，但還是可以表現為極弱的RhD抗原。到目前為止，臨床上DEL表型的血液一直作為Rh陰性血液使用。最近已經有DEL血型血液輸注給Rh陰性患者，從而導致抗D免疫事件發生的報道。因此在我國Rh陰性獻血者中開展檢測DEL血型很有必要，這是臨床安全輸血的重要保障。通過檢測53例RHD 1227A標本，提示基因分型方法可以有效地檢測RHD 1227A等位基因，同時基因分型的方法還可以利用血站的核酸檢測系統實現自動化檢測，這為臨床上大規模開展DEL表型篩選創造了可能。
綜上所述，ASPCR方法可用于臨床篩選Rh陰性人群中的DEL表型。
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