巨噬細(xì)胞

開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創(chuàng)造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇巨噬細(xì)胞，希望這些內(nèi)容能成為您創(chuàng)作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進(jìn)步。

第1篇

巨噬細(xì)胞活化綜合征(macrophage activation syndrome,MAS)是兒童慢性風(fēng)濕性疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥,臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱,淋巴結(jié)及肝脾腫大,全血細(xì)胞減少,嚴(yán)重肝功能損害,凝血障礙及神經(jīng)系統(tǒng)受累等多臟器病變,骨髓細(xì)胞學(xué)顯示有分化良好的巨噬細(xì)胞吞噬血細(xì)胞現(xiàn)象[1]。1985年Hadchouel等[2]。第一次報(bào)道了soJIA患兒病程中出現(xiàn)類似MAS的臨床表現(xiàn),提示可能與大量異常活化的非腫瘤性巨噬細(xì)胞所致的噬血細(xì)胞現(xiàn)象相關(guān)。1993年Stephan等[3]首次提出了MAS的概念,他們發(fā)現(xiàn)這些患者存在單核巨噬細(xì)胞活化,臨床表現(xiàn)與噬血性淋巴組織細(xì)胞增生癥(HLH)相似。隨后MAS這個(gè)概念逐漸被風(fēng)濕病學(xué)界認(rèn)識(shí)和接受,關(guān)于MAS的報(bào)道也逐漸增多,近年來其他風(fēng)濕性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、川崎病、滲出性多形性紅斑等[4]也有合并MAS的報(bào)道。現(xiàn)就巨噬細(xì)胞活化綜合征近年來的研究進(jìn)展做一綜述。

1 MAS的流行病學(xué)特點(diǎn)

MAS是風(fēng)濕性疾病少見的并發(fā)癥,目前尚無確切的關(guān)于MAS發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。隨著MAS研究的不斷深入,MAS的報(bào)道越來越多。胡堅(jiān)等[5,6]對(duì)幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathic arthritis,JIA)并發(fā)MAS的個(gè)案報(bào)道是國內(nèi)最早的文獻(xiàn)資料,隨后人們開始關(guān)注到MAS在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎全身型(soJIA)中并不少見[7-9]。Sawhne等[10]。報(bào)道103例全身型JIA患者中有7例合并MAS。Emmennegger等[11]。對(duì)反應(yīng)性HLH患者進(jìn)行同顧性研究發(fā)現(xiàn)約1/3的HLH患者滿足JIA的診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前認(rèn)為MAS男女發(fā)病率沒有明顯差異,沒有種族易感性,任何年齡均可發(fā)病,以兒童發(fā)病多見,并且大部分MAS患者存在有基礎(chǔ)病。

2 MAS的誘發(fā)因素

MAS發(fā)病確切的誘因尚不明確,可能與原發(fā)病活動(dòng)、藥物作用、感染等有關(guān)。任何感染均可誘發(fā)MAS,包括病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲等感染。EB病毒是誘發(fā)MAS最常見的感染因素,單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒等也被認(rèn)為是引起MAS常見的誘因。近10年的文獻(xiàn)資料顯示在治療soJIA過程中某些藥物可能引發(fā)MAS,這些藥物包括NSAIID類藥物(阿司匹林、布洛芬等)、病情改善藥物(金制劑、甲氨蝶呤等)、免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺)[13]和生物制劑(如TNF拮抗劑依那西普)[14、15]等。

3 MAS的發(fā)病機(jī)制

MAS確切發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚,大部分關(guān)于MAS發(fā)病機(jī)制的假說都源于HLH。近年來研究發(fā)現(xiàn),MAS的發(fā)病機(jī)制可能與穿孔素(perforin)基因異常表達(dá)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)功能紊亂引發(fā)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子所致的瀑布反應(yīng)有關(guān)[10-16]。穿孔素基因突變導(dǎo)致穿孔素蛋白表達(dá)減少[17],穿孔素蛋白是淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓的前體細(xì)胞表達(dá)的一種蛋白質(zhì),它的主要作用是在細(xì)胞溶解過程中在細(xì)胞膜上形成小孔,引起靶細(xì)胞溶解。新近的研究也顯示多次發(fā)生MAS的soJIA患者,大部分穿孔素蛋白表達(dá)降低。曾華松等口朝對(duì)7例So-JIA并發(fā)MAS患者的研究發(fā)現(xiàn),穿孔素A91V基因均為野生型,未發(fā)現(xiàn)有突變基因,未發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)漢族So-JIA并MAS患兒與穿孔素A91V基因多態(tài)性有關(guān),考慮可能與個(gè)體特異體質(zhì)有關(guān)。NK細(xì)胞在感染早期具有清除感染原作用,soJIA患者合并MAS中,NK細(xì)胞的數(shù)量和功能均降低。姚翠嬋等[20]報(bào)道10例soJIA病情反復(fù)難治者,發(fā)現(xiàn)9例患兒外周血NK細(xì)胞CDl6+56+比率降低,這些患兒并發(fā)MAS機(jī)會(huì)明顯增加,這也是soJIA患者容易并發(fā)MAS的原因[21]。當(dāng)NK細(xì)胞功能下降,機(jī)體清除外來感染原能力降低,引起抗原驅(qū)動(dòng)下T淋巴細(xì)胞持久激活和巨噬細(xì)胞活化因子大量產(chǎn)生,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞過度活化釋放大量炎癥細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α及干擾素α),即細(xì)胞因子瀑布,從而引起強(qiáng)烈自身免疫損傷[22],出現(xiàn)各種臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室改變。對(duì)soJIA患兒檢測其NK細(xì)胞功能及穿孔素蛋白表達(dá)水平,也許有助于預(yù)測MAS的發(fā)生。

4 組織病理學(xué)特征

MAS的組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞及活化的巨噬細(xì)胞浸潤。在骨髓及淋巴結(jié)中出現(xiàn)巨噬細(xì)胞噬血現(xiàn)象,浸潤也可出現(xiàn)在其他組織和臟器。1988年,Reiner等[23]對(duì)MAS患者的尸解研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤可出現(xiàn)在心臟、肝臟、胰腺、腎上腺及腦膜等。Billiau等[24]。報(bào)道了5例MAS患兒肝活檢病理結(jié)果顯示活化的CD8、T細(xì)胞和噬血細(xì)胞增生都參與了發(fā)病。

5 臨床特征與實(shí)驗(yàn)室改變

5.1各系統(tǒng)臨床表現(xiàn)MAS主要并發(fā)于soJIA,多數(shù)發(fā)生于疾病活動(dòng)期,少數(shù)也可發(fā)生在疾病的靜止期,個(gè)別病例甚至作為soJIA的首發(fā)癥狀[25]。MAS的起病非常急驟,進(jìn)展迅速,其臨床主要表現(xiàn)為多臟器受累癥狀,甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙或衰竭。重癥者預(yù)后差,病死率高。

發(fā)熱常常是MAS的首發(fā)癥狀,主要表現(xiàn)為高熱持續(xù)不退,多為稽留熱,有時(shí)為弛張熱。

肝臟受累在MAS中非常常見,表現(xiàn)為肝功能急劇減退甚至衰竭,出現(xiàn)惡心、嘔吐、黃疸、出血傾向及肝酶短期內(nèi)迅速升高,伴有肝脾進(jìn)行性增大。

MAS最具有鑒別診斷意義的臨床表現(xiàn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累和出血順向[26]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)為一系列中樞神經(jīng)功能障礙,包括嗜睡、煩躁、定向力障礙、頭痛、抽搐甚至昏迷等,部分患者出現(xiàn)頸項(xiàng)強(qiáng)直、肌張力異常(增高或降低),顱神經(jīng)麻痹、失明、共濟(jì)失調(diào)及偏癱也不少見。出血傾向以皮膚黏膜出血為主要表現(xiàn),類似于DIC,是MAS患者中最突出的異常表現(xiàn),主要是凝血功能障礙所致,輕者表現(xiàn)為皮膚黏膜瘀點(diǎn)及瘀斑,較重的可有暴發(fā)性紫癜,鼻衄、消化道出血,甚至出現(xiàn)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)。

其他系統(tǒng)受累現(xiàn)象相對(duì)較少見。呼吸系統(tǒng)受累可出現(xiàn)呼吸衰竭,甚至急性呼吸窘迫綜合征。腎臟受累表現(xiàn)為血尿,蛋白尿,少尿及無尿,部分患兒可以出現(xiàn)。腎功能衰竭。心臟受累表現(xiàn)包括心包炎、心肌炎,心力衰竭及心律失常等。以上器官受累一經(jīng)發(fā)生往往提示多臟器功能受累,預(yù)后不良,曾華松等[19]報(bào)道提示MOt-的發(fā)生是MAS預(yù)后差的指征。

5.2 實(shí)驗(yàn)室改變MAS患者血象改變主要表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板一系或者一系以上降低。肝酶升高如ALT、AST、LDH及GGT增高。膽紅素輕度升高,以直接膽紅素升高為主。血脂包括甘油三酯可以增高,低白蛋白血癥,血氨水平多正常或輕度增高,血鈉下降等。凝血功能異常可有PT及APTT延長,纖維蛋白原降低,FDP增高,D-二聚體升高,V因子輕度下降,維生素K依賴凝血因子缺乏等。血沉(ESR)降低是MAS特征性實(shí)驗(yàn)室改變。血清鐵蛋白的明顯升高也是MAS特征性改變之一。骨髓細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為反應(yīng)性組織細(xì)胞增生,無惡性細(xì)胞浸潤,極期可見吞噬紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的吞噬性組織細(xì)胞。骨髓、淋巴結(jié)及肝臟活檢可見分化良好的極度增生活躍吞噬了血細(xì)胞的吞噬細(xì)胞[24]。

6 診斷標(biāo)準(zhǔn)與鑒別診斷

6.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)MAS目前尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。2005年,Ravelli等[26]根據(jù)流行病學(xué)研究資料,提出了全身型JIA合并MAS的診斷指南,見表1。

表1SOJIA合并MAS的參考診斷指標(biāo)(2005年)

臨床標(biāo)準(zhǔn)

(1)CNS功能障礙(易激惹、定向力障礙、嗜睡、頭痛、抽搐、昏迷)

(2)出血表現(xiàn)(紫癜、易出血、黏膜出血)

(3)肝睥增大(肋緣下≥3 cm)

實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)

(1)血小板≤262×109/L

(2)谷草轉(zhuǎn)氨酶>59 U/L

(3)白細(xì)胞≤4.O×109/L

(4)纖維蛋白原降低(≤2.5 g/L)

組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)

骨髓有巨噬細(xì)胞吞噬血細(xì)胞的證據(jù)

診斷原則:診斷MAS需要任何2個(gè)或以上的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn),3個(gè)或以上的臨床和(或)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)。骨髓中發(fā)現(xiàn)吞噬血細(xì)胞,僅僅是對(duì)于可疑病例才必須具備。

建議:上述診斷指標(biāo)僅用于活動(dòng)性s0JRA合并MAS,實(shí)驗(yàn)室檢查值僅作為參考。

6.2 鑒別診斷診斷MAS必須排除其他疾病,如感染性疾病(如敗血癥、EB病毒感染),惡性疾病(如白血病、淋巴瘤及惡性組織細(xì)胞病),瑞氏綜合癥,以及藥物副作用等。近年來人們認(rèn)識(shí)到MAS與HLH的關(guān)系非常密切,臨床上難以鑒別。HLH是組織細(xì)胞增生癥的一種類型,是以表型良性分化的單核細(xì)胞聚集為特征的疾病譜。HLH分為兩類,一類為原發(fā)性(家族性),是常染色體隱性遺傳病,多散發(fā);另一類為繼發(fā)性(反應(yīng)性),又分為感染相關(guān)性和腫瘤相關(guān)性HLH,多在兒童期發(fā)病,往往有明確誘發(fā)因素,比如EB病毒或巨細(xì)胞病毒感染。MAS的臨床表現(xiàn)及組織病理特點(diǎn)與HLH非常相似,但有其特殊性。2004年,國際組織細(xì)胞協(xié)會(huì)將。MAS做為獨(dú)立疾病單獨(dú)列出,分類在繼發(fā)性HLH中,特別強(qiáng)調(diào)與其他HIJH在治療方案上的不同。2005年,美國血液病協(xié)會(huì)也將其單獨(dú)描述,提出MAS與HLH的密切關(guān)系,強(qiáng)調(diào)HLH的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案不一定符合MAS,提示了MAS的特殊性。雖然HLH及MAS兩者的關(guān)系尚不清楚,在學(xué)術(shù)界上尚有爭議,但隨著對(duì)該病認(rèn)識(shí)的不斷深入,越來越多的學(xué)者認(rèn)為MAS是屬于組織細(xì)胞疾病范疇的風(fēng)濕病相關(guān)性HLH[25-28]。

7 治 療

MAS是全身型JIA一種嚴(yán)重并發(fā)癥,有很高的病死率,做到早期診斷、早期治療至關(guān)重要,可以極大的改善預(yù)后,已往報(bào)道病例多數(shù)在短期內(nèi)臨床治愈。目前常用的治療方法包括一般治療及特殊藥物治療。

7.1 一般治療針對(duì)MAS發(fā)病的不同誘因,存在感染時(shí)進(jìn)行抗感染治療,及時(shí)停用可疑藥物,針對(duì)患兒臟器功能狀態(tài)做相應(yīng)的呼吸循環(huán)支持等治療。

7.2 藥物治療主要包括腎上腺皮質(zhì)激素及環(huán)孢素A。輕癥患兒口服潑尼松1～2mg/(Kg.d),癥狀體征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)好轉(zhuǎn)后緩慢減量。重癥患兒常常需要大劑量甲潑尼松龍沖擊療法,劑量為15～30mg/(Kg.d),最大劑量為lg/d,連續(xù)使用3～5天,之后改為口服維持,可降低巨噬細(xì)胞活化復(fù)發(fā)。環(huán)孢素A對(duì)一些巨噬細(xì)胞活化的疾病如HLH有明顯效果[32,33],但其明確的免疫學(xué)機(jī)制并不十分確切。常用劑量為2～8mg/Kg.d,急性期應(yīng)靜脈用藥,病情控制后改為口服治療。此外,使用環(huán)孢菌素A還能避免腎上腺皮質(zhì)激素的過度使用。用藥期間應(yīng)定期監(jiān)測血藥濃度及腎功能,據(jù)此調(diào)整治療劑量。細(xì)胞因子拮抗劑如TNF受體拮抗劑依那西普(Etancerept)和LT拮抗劑阿那白滯素(Anakinra)也有一定療效,但易致感染發(fā)生,用藥前應(yīng)明確有無感染存在。靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)、免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺等)、化療藥物(如VPl6)以及血漿置換治療因療效不確切,目前使用較少。新近開展的自體干細(xì)胞移植可能為MAS的治療帶來新的希望。

8 展 望

MAS是全身型JIA一種嚴(yán)重并發(fā)癥,在臨床上并不少見,早期診斷和早期治療對(duì)其預(yù)后至關(guān)重要。雖然廣大兒科醫(yī)師已逐漸認(rèn)識(shí)到MAS的重要性,但目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于soJIA合并MAS發(fā)病率的確切資料,對(duì)其發(fā)病機(jī)制也尚不清楚。因此,有必要開展前瞻性的多中心、大樣本流行病學(xué)調(diào)查,以了解soJIA合并MAS的發(fā)病率;相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展,人們對(duì)MAS病因和發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)會(huì)不斷清晰,對(duì)制訂MAS的診斷標(biāo)準(zhǔn)將會(huì)更加科學(xué)合理;干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展,將給MAS根治帶來無限的希望。

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第2篇

【摘要】

目的： 檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs表達(dá)情況及糖皮質(zhì)激素甲基強(qiáng)的松龍對(duì)TLRs mRNA表達(dá)的影響. 方法： 應(yīng)用RTPCR檢測正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR113的表達(dá)；并以甲基強(qiáng)地松龍為免疫抑制劑，誘導(dǎo)小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細(xì)胞TLRs mRNA表達(dá)變化. 結(jié)果： 已發(fā)現(xiàn)的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)糖皮質(zhì)激素處理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上調(diào). 結(jié)論： Toll樣受體是抗真菌先天免疫的重要組成部分. 甲基強(qiáng)的松龍對(duì)巨噬細(xì)胞有毒性作用，甲基強(qiáng)的松龍注射后可導(dǎo)致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞明顯減少.

【關(guān)鍵詞】 小鼠；潑尼松龍；免疫抑制法；Toll樣受體

【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.

【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor

0引言

Toll受體在果蠅的發(fā)育和抗真菌免疫中具有顯著作用. 實(shí)驗(yàn)證實(shí)TLRs(tolllike receptors)表達(dá)異常會(huì)使免疫炎癥反應(yīng)不能正常發(fā)生，降低機(jī)體對(duì)病原微生物的清除能力［1］. 糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎癥和抑制免疫反應(yīng)［2］. 近20年來，由于應(yīng)用糖皮質(zhì)激素而致機(jī)體免疫機(jī)能低下的患者患侵襲性曲霉菌病日趨增多. 體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示糖皮質(zhì)激素在免疫和炎癥應(yīng)答中有促進(jìn)和抑制作用，甚至出現(xiàn)雙向作用［3］. 為了解糖皮質(zhì)激素對(duì)TLRs表達(dá)的影響，我們以甲基強(qiáng)地松龍為免疫抑制劑，在誘導(dǎo)小鼠免疫抑制后檢測腹腔巨噬細(xì)胞TLRs mRNA的表達(dá)情況.

1材料和方法

1.1材料

Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量20～25g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）. 總RNA提取試劑TRIZOL  Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基強(qiáng)的松龍，40 mg/支(比利時(shí)法瑪西亞普強(qiáng)公司).

1.2方法

1.2.1糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)小鼠免疫抑制及腹腔巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)

將免疫抑制組小鼠12只皮下注射甲基強(qiáng)的松龍100 mg/kg·d， 共3 d. 正常對(duì)照組小鼠12只皮下注射同體積注射用水. 第4日脫頸處死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪開腹部皮膚，暴露腹部，用注射器吸取5 mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液注入腹腔，輕揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬細(xì)胞懸液，移入離心管中計(jì)數(shù).

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取

收集腹腔巨噬細(xì)胞懸液，2000 g離心10 min，棄上清，RPMI1640洗滌1次. 用TRIZOL  Reagent一步法提取巨噬細(xì)胞總RNA.

1.2.3TLR1~13 PCR引物

根據(jù)GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成（表1）. 表1基因名稱和序列（略）

1.2.4RTPCR擴(kuò)增TLR1～13基因及內(nèi)參照βactin基因按照說明書，以Random Primers為引物，將從小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA. 分別用TLR及內(nèi)參照βactin兩組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循環(huán)32次，延伸7 min.

1.2.5擴(kuò)增產(chǎn)物檢測取10 μL PCR產(chǎn)物，15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳40 min，隨后在凝膠成像系統(tǒng)中分析電泳帶的吸光度值. TLRs的相對(duì)含量為TLRs與內(nèi)參βactin吸光度比值表示.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用KruskalWallis H檢驗(yàn).

2結(jié)果

2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量變化將甲基強(qiáng)的松龍注射后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞數(shù)量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P

2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)經(jīng)RTPCR檢測，TLR113在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)(圖1).

2.3免疫抑制狀態(tài)下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs的表達(dá)變化糖皮質(zhì)激素可上調(diào)巨噬細(xì)胞上部分TLRs mRNA表達(dá)(圖1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表達(dá)量增加約1.2～2.0倍(表2). 若

3討論

TLRs在不同組織細(xì)胞的表達(dá)各異 ，可分為廣泛表達(dá)、限制性表達(dá)或特異性表達(dá)［4］，如TLR1分布于各類免疫細(xì)胞，TLR2，4，5只在髓源性細(xì)胞表達(dá)，TLR3則主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為常駐巨噬細(xì)胞，是防御病原微生物入侵的第一道防線. Muzio 等［5］研究顯示， 單核/巨噬細(xì)胞在發(fā)育成熟的不同階段表達(dá)大多數(shù)TLRs，但不表達(dá)TLR3. 我們的結(jié)果證明TLR113在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均有表達(dá)，包括TLR3. 當(dāng)局部受到細(xì)菌、真菌及病毒感染時(shí)，巨噬細(xì)胞上的TLRs可識(shí)別不同的病原體相關(guān)分子模式如細(xì)菌脂肽、dsRNA，LPS和細(xì)菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫應(yīng)答并啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答.

多種病原微生物成分或細(xì)胞因子可上調(diào)或下調(diào)TLRs表達(dá)，如LPS可誘導(dǎo)TLR2，TLR4及TLR9的表達(dá)，IL6可使TLR7的表達(dá)明顯升高，INFγ可上調(diào)TLR9的表達(dá). Renshaw等［6］研究證實(shí)，老齡小鼠的脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞TLR1～9的表達(dá)顯著減少，且TLRs功能下降，這可能部分解釋老年人對(duì)各種病原菌感染的易感性增加. 糖皮質(zhì)激素是廣泛應(yīng)用的抗炎劑，其抗炎效應(yīng)的發(fā)揮是通過下調(diào)依賴NFκB的大量炎癥應(yīng)答相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而TLRs的上調(diào)可誘導(dǎo)NFκB的活化［7］. 研究發(fā)現(xiàn)，大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是機(jī)會(huì)性真菌易感的主要危險(xiǎn)因素之一，理論上推測糖皮質(zhì)激素可能下調(diào)TLRs表達(dá). 我們的結(jié)果顯示，甲基強(qiáng)的松龍?jiān)趍RNA水平上調(diào)巨噬細(xì)胞部分TLRs表達(dá)，其調(diào)節(jié)機(jī)制還不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞TLRs家族成員表達(dá)的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)地塞米松可上調(diào)TLR2～6的表達(dá)，與我們的研究結(jié)果相一致. Shuto等［7］研究證實(shí)，地塞米松協(xié)同增強(qiáng)非典型流感嗜血桿菌誘導(dǎo)的TLR2上調(diào)，是通過p38MAPK信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)節(jié). Franchimont等［9］將地塞米松加入LPS刺激的全血細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，證明了糖皮質(zhì)激素可強(qiáng)烈抑制Th1細(xì)胞促炎因子的分泌，而對(duì)Th2細(xì)胞抗炎因子的分泌有正調(diào)節(jié)作用. 糖皮質(zhì)激素對(duì)巨噬細(xì)胞部分TLRs有上調(diào)作用，免疫功能低下患者易發(fā)生機(jī)會(huì)性感染，但究竟是通過對(duì)Toll樣受體信號(hào)通路中哪些環(huán)節(jié)的抑制而發(fā)揮作用的？糖皮質(zhì)激素上調(diào)部分TLRs表達(dá)的準(zhǔn)確分子機(jī)制是什么？這將有待于進(jìn)一步研究.

以往研究認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素可明顯改變單核巨噬細(xì)胞的功能，能抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和加工處理抗原功能，阻止單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞. 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到糖皮質(zhì)激素甲基強(qiáng)的松龍對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用，甲基強(qiáng)的松龍注射后可導(dǎo)致小鼠腹腔巨噬細(xì)胞明顯減少，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)甲基強(qiáng)的松龍作用后細(xì)胞生長受到抑制甚至死亡. 尚未見文獻(xiàn)報(bào)道糖皮質(zhì)激素對(duì)巨噬細(xì)胞的直接毒性作用，甲基強(qiáng)的松龍抑制巨噬細(xì)胞生長或誘導(dǎo)死亡可能是免疫抑制小鼠對(duì)煙曲霉菌易感的機(jī)制之一.

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第3篇

關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞；魚紅細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)方法；吞噬

中圖分類號(hào) G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）23-17-02

高等動(dòng)物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干細(xì)胞分化而來，是機(jī)體非特異性免疫功能的重要組成部分。當(dāng)病原微生物或其他異物侵入機(jī)體時(shí)，由于巨噬細(xì)胞具有趨化性，便向異物處聚集，巨噬細(xì)胞可將之內(nèi)吞入胞質(zhì)，形成吞噬泡，然后在胞內(nèi)與溶酶體融合，將異物消化分解，這在機(jī)體非特異性免疫中具有重要意義。靜息的巨噬細(xì)胞吞噬功能低下，只有活化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞才具有較強(qiáng)的吞噬能力。現(xiàn)在所用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)教材[1-4]所編列吞噬實(shí)驗(yàn)大多用雞紅細(xì)胞、羊紅細(xì)胞、墨水、桿菌[5]、熒光微球等作為吞噬物，本文首次使用魚血細(xì)胞作為吞噬物，對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬效果進(jìn)行了探索和研究，以期避免使用家禽作為實(shí)驗(yàn)材料，并進(jìn)一步完善了實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 魚血紅細(xì)胞稀釋液的制備 從市場上購買鯽魚，用注射器尾靜脈采血，或解剖后從魚血竇或心臟抽取魚血。抽取的魚血，不添加抗凝劑，直接用無血清L15培養(yǎng)基（Gibco，invitrogen Corporation），稀釋10倍。配成10%魚血紅細(xì)胞懸液備用。

1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制備 稱取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理鹽水中，混勻后121℃高壓滅菌20min備用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo) 在實(shí)驗(yàn)前3d，連續(xù)3d定時(shí)給小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持針以45°斜角刺入，注意勿傷及內(nèi)臟或注入腸內(nèi)，注射后揉動(dòng)腹部，分散淀粉粒，并觀察注射后動(dòng)物狀態(tài)，以免小鼠死亡。

1.2.2 魚紅細(xì)胞的注射及腹腔液的收集 實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠腹腔注射10%魚紅細(xì)胞懸液1mL，輕按小鼠腹部，使懸液分散。60min后，用頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齒尖鑷夾起皮膚層，用剪刀剪一環(huán)口，撕開腹部皮膚，充分暴露腹膜。此時(shí)，向腹腔注射1mL生理鹽水，并輕揉腹部片刻。隨后用剪刀剪開腹膜成一縱形口，用鑷子將兩邊皮膚夾起來，以防腹腔液流出。把內(nèi)臟推向一側(cè)后，可用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔內(nèi)血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血細(xì)胞。

1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于潔凈的載玻片上，按血涂片制備法制備細(xì)胞涂片。空氣干燥后，載片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的載片，采用扣染法，即用牙簽架起載片，細(xì)胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸緩沖液9份）染色載片，染色時(shí)間為20min。染色完成后，揭起載片，用滴管吸取蒸餾水輕緩沖洗載片，洗去多余的染液。

1.2.4 顯微觀察及吞噬百分率和吞噬指數(shù)的計(jì)算 載片空氣干燥后，在OLympus BX41顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭進(jìn)行顯微拍攝，并用IPP5.0軟件進(jìn)行顯微照片標(biāo)尺標(biāo)記。40倍物鏡下已能觀察到游離的魚紅細(xì)胞及吞噬魚紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共用小鼠5只，實(shí)驗(yàn)過程中未出現(xiàn)死亡，每只小鼠制備5片涂片。每片隨機(jī)觀察數(shù)個(gè)視野，記錄100個(gè)吞噬細(xì)胞的吞噬結(jié)果，計(jì)算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率（%）=吞噬魚紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù)（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指數(shù)=巨噬細(xì)胞中所吞噬的魚紅細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的總巨噬細(xì)胞數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞吞噬狀態(tài) 在普通光學(xué)顯微鏡下，可清晰觀察到主要的三類細(xì)胞，魚紅細(xì)胞、未吞噬魚紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞（圖1中1）及吞噬一個(gè)或數(shù)個(gè)魚紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞（圖1中2～4）。鯽魚紅細(xì)胞多為長橢圓形，核常位于細(xì)胞中部，胞核染為深紫色。巨噬細(xì)胞大多呈不規(guī)則形狀，胞體表面不光滑，常有突觸，細(xì)胞核較大，呈腎形、圓形或其他不規(guī)則形狀，染為紫紅色。巨噬細(xì)胞吞噬魚紅細(xì)胞，常能觀察到以下幾種吞噬狀態(tài)：巨噬細(xì)胞內(nèi)魚紅細(xì)胞膜仍完整；巨噬細(xì)胞內(nèi)魚紅細(xì)胞膜不完整或破裂；巨噬細(xì)胞內(nèi)具有一個(gè)或數(shù)個(gè)大小不等的魚紅細(xì)胞細(xì)胞核；還可觀察到巨噬細(xì)胞膜凹陷，魚紅細(xì)胞緊貼在凹陷處正在被吞噬。圖1顯示激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞及多種吞噬魚紅細(xì)胞的狀態(tài)。

2.2 吞噬率和吞噬指數(shù) 實(shí)驗(yàn)測得小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬魚紅細(xì)胞的吞噬率為25.0%，吞噬指數(shù)為0.31。與雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)相近[6-7]。

3 討論

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)是生物科學(xué)及醫(yī)學(xué)專業(yè)本科層次細(xì)胞生物學(xué)課程開設(shè)的實(shí)驗(yàn)必修項(xiàng)目。近年來，由于禽流感[8]的流行，細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室通過多次試驗(yàn)、反復(fù)摸索和研究“小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)”這一實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上不斷改進(jìn)。主要的改進(jìn)有以下3個(gè)方面：一是采用小鼠實(shí)驗(yàn)前連續(xù)3d定時(shí)免疫，有效增加了腹腔內(nèi)處于激活狀態(tài)的巨噬細(xì)胞數(shù)量。二是取魚血紅細(xì)胞作為吞噬物，且所取魚血不用添加抗凝劑，直接用不加血清的L15細(xì)胞培養(yǎng)液來稀釋血細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)效果明顯，完全符合實(shí)驗(yàn)要求。三是染色方法的好壞直接關(guān)系到對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Giemsa染色扣染法，巨噬細(xì)胞及魚紅細(xì)胞染色均清晰，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)更加明顯，能有效地分辨各類細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞漿及吞噬魚紅細(xì)胞的各種狀態(tài)。此實(shí)驗(yàn)方法已用于我院本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)，師生們普遍認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果便于學(xué)生觀察和計(jì)數(shù)，有助于學(xué)生對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬作用的理解和掌握，提高教學(xué)效果。

綜上所述，采用魚血細(xì)胞作為吞噬物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯，吞噬率及吞噬指數(shù)均高于或接近于雞紅細(xì)胞的數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步完善了實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀與清晰。同時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)常用于免疫增強(qiáng)藥物活性的測定，其中以體內(nèi)法最能反應(yīng)實(shí)際吞噬能力，這一方法常用雞紅細(xì)胞來進(jìn)行測定，是否也可用便于取材的魚紅細(xì)胞來測定，值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。

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第4篇

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形燒傷科，四川瀘州646000

[摘要] 中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在整個(gè)燒傷免疫過程中起者重要作用。所以弄清嚴(yán)重?zé)齻笾行粤＜?xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能變化及其所帶來的影響對(duì)預(yù)防燒傷后并發(fā)膿毒血癥、多器官功能衰竭顯得尤為重要。現(xiàn)將嚴(yán)重?zé)齻笾行粤＜?xì)胞、巨噬細(xì)胞的功能變化及其影響作一綜述。

關(guān)鍵詞 燒傷；中性粒細(xì)胞；巨噬細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R644.02[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-0742（2014）04（b）－0195-02

[作者簡介]賴曉敏（1987.7-），男，四川人，碩士， 主要從實(shí)整形燒傷工作。

嚴(yán)重?zé)齻蟛l(fā)膿毒血癥、多器官功能衰竭是目前燒傷重要的死亡原因之一，其病情發(fā)展快，死亡率極高。是目前燒傷治療所面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[1-3]。究其本質(zhì)是有炎癥因子所介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。而中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclear neutrophils，PMN）、巨噬細(xì)胞（Macrophages，m）在整個(gè)過程中起著重要作用。所以弄清嚴(yán)重?zé)齻驪MN、巨噬細(xì)胞的功能變化及其所帶來的影響對(duì)預(yù)防燒傷后并發(fā)膿毒血癥、多器官功能衰竭顯得尤為重要。現(xiàn)將嚴(yán)重?zé)齻驪MN、巨噬細(xì)胞的功能變化及其影響作一綜述。

1中性粒細(xì)胞的生理特點(diǎn)和功能

PMN是外周血含量最多的白細(xì)胞，具有變形、游走、趨化、吞噬和分泌等特性。①PMN能伸出偽足做變形運(yùn)動(dòng)，通過這種運(yùn)動(dòng)，PMN得以穿過毛細(xì)血管壁。②滲出到血管外的PMN可以借助變形運(yùn)動(dòng)在組織內(nèi)游走。③在趨化因子的作用下PMN可以朝向某些特定的化學(xué)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)。這些趨化因子包括兩大類：外源性趨化因子和內(nèi)源性趨化因子。外源性趨化因子包括：可溶性細(xì)菌產(chǎn)物（含有N-甲酰基蛋氨酸末端的多肽）。內(nèi)源性趨化因子包括：補(bǔ)體成分（如C5a）、白三烯、細(xì)胞因子（IL18）等。④PMN到達(dá)炎癥病灶后，通過其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的嗜天青顆粒和特異性顆粒所含有的水解酶、中性蛋白酶、MPO、陽離子蛋白、溶酶菌乳貼蛋白及堿性磷酸酶將細(xì)菌殺滅。⑤PMN在趨化、吞噬過程中還可釋放溶酶體酶、活性氧自由基、前列腺素，白三烯等損傷內(nèi)皮細(xì)胞和組織，加重原有的損傷。

2巨噬細(xì)胞的生理特點(diǎn)和功能

巨噬細(xì)胞是由未發(fā)育成熟的單核細(xì)胞遷入組織中繼續(xù)發(fā)育而成的具有吞噬和免疫功能的細(xì)胞。其細(xì)胞體積較大，可達(dá)60~80 μm，溶酶體顆粒和線粒體數(shù)目增多。因此，巨噬細(xì)胞的吞噬能力強(qiáng)，可吞噬更多更大的細(xì)菌和顆粒。①免疫功能：巨噬細(xì)胞能合成和釋放多種細(xì)胞因子，包括CSF、白細(xì)胞介素（IL-1、IL-3、IL-6、IL-18），腫瘤壞死因子、干擾素等。有研究表明，巨噬細(xì)胞可提高HLADR-CD86 等抗原提呈分子的表達(dá)，釋放單核細(xì)胞趨化因子MCP-1，TNF -a等多種炎癥因子，誘導(dǎo)和活化其他炎性細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中起著重要作用[4]。②吞噬功能：能夠吞噬病原體和壞死細(xì)胞，有助于啟動(dòng)康復(fù)過程。巨噬細(xì)胞吞噬病原體和壞死細(xì)胞的過程包括識(shí)別、吞入、殺傷和降解。巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞表面的非特異性受體吞噬病原菌和壞死細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是通過介導(dǎo)吞噬的相關(guān)受體與微生物表面接觸，從而啟動(dòng)復(fù)雜的信號(hào)通道，通過細(xì)胞骨架的重排和膜的輸送介導(dǎo)對(duì)微生物細(xì)胞吞噬效應(yīng)[5-6]。當(dāng)病原菌進(jìn)入吞噬溶酶體后可被依賴和非依賴氧途徑殺傷和降解。

3嚴(yán)重?zé)齻笾行粤＜?xì)胞功能的變化及其影響

PMN在整個(gè)炎癥反應(yīng)發(fā)生過程中起著重要作用，嚴(yán)重?zé)齻驪MN不僅可以穿過血管壁聚集到損傷區(qū)域， 吞噬異物、殺滅細(xì)菌[7]，還可直接釋放炎癥介質(zhì)，且與內(nèi)皮細(xì)胞黏附后可造成自身組織損傷[8]。①嚴(yán)重?zé)齻驪MN延遲凋亡。有研究表明[9-12]，嚴(yán)重?zé)齻驪MN的凋亡發(fā)生延遲，而延遲凋亡的PMN可發(fā)生繼發(fā)性壞死，釋放大量炎性物質(zhì)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，促發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），導(dǎo)致局部和全身的組織損傷甚至臟器的損傷。②PMN的趨化功能改變。PMN趨化因子包括：病原菌、補(bǔ)體C3a、C5a、C、纖維蛋白降解產(chǎn)物、纖維肽B和血管舒緩素等。嚴(yán)重?zé)齻螅琍MN的趨化性立即增加，主要是因?yàn)椴荒蜔岽碳せ顒?dòng)的增加，然后其趨化性逐漸減弱。而PMN趨化性減弱的時(shí)間出現(xiàn)越早，其持續(xù)時(shí)間將越長。有研究表明[13]燒傷后創(chuàng)面應(yīng)用磺胺嘧啶銀的患者，其血清對(duì)正常人PMN的趨化性有抑制作用。實(shí)驗(yàn)證明，IL-18能夠促進(jìn)PMN的趨化作用[14]。腹腔注射IL-18后，能夠增加腸道PMN的浸潤，導(dǎo)致腸道組織水腫[15]。③嚴(yán)重?zé)齻驪MN的吞噬功能明顯下降，早期吞噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬細(xì)胞百分率下降，一周左右恢復(fù)。有文獻(xiàn)報(bào)道[16]大鼠5Gy60Coγ射線全身照射復(fù)合15%TBSAⅢ度光輻射燒傷后，PMN的吞噬功能明顯降低。④中性粒細(xì)胞的殺菌功能改變。當(dāng)病原菌被PMN吞噬后，主要通過氧依賴過程和氧不依賴過程進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)殺滅細(xì)菌。有實(shí)驗(yàn)證明[17]燒傷后各種因素均可激活中性粒細(xì)胞，如壞死組織、缺血、缺氧、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等。不但可使PMN生成增加，也使外周血中成熟的PMN游出血管，PMN到達(dá)創(chuàng)傷部位可釋放出氧自由基、蛋白水解酶等起著殺菌作用，同時(shí)也造成組織新的損傷，表現(xiàn)為創(chuàng)面的加深和擴(kuò)大。

4嚴(yán)重?zé)齻缶奘杉?xì)胞功能的變化及其影響

人體具有免疫功能的細(xì)胞主要包括嗜PMN、單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等。其數(shù)量和功能與感染密切相關(guān)，而在這些免疫細(xì)胞中，M發(fā)揮著極其重要的作用。燒傷后巨噬細(xì)胞活化，分泌能力增強(qiáng)， 大量釋放炎癥介質(zhì)，是引起全身炎癥反應(yīng)綜合征的原因之一。（1）燒傷后部分巨噬細(xì)胞的表型可發(fā)生改變。有實(shí)驗(yàn)證明：①燒傷后巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的量增加。Schwacha等[18]證明，燙傷小鼠的脾臟巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活性增加。②巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的量呈明顯增加[19]。③燙傷小鼠脾臟巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶2（COX-2）的活性增加[20]。④燒傷后巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10的量增加。以上均提示燙傷引起了巨噬細(xì)胞表型的變化。（2）嚴(yán)重?zé)齻驧的免疫功能改變：研究表明[21]，燒傷后巨噬細(xì)胞被激活，巨噬細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗原提呈功能的人白細(xì)胞DR抗原的表達(dá)率明顯下降，下降的程度及所持續(xù)的時(shí)間與燒傷嚴(yán)重程度有關(guān)。目前認(rèn)為：當(dāng)DR抗原表達(dá)率不足30%時(shí)，可認(rèn)為單核細(xì)胞免疫麻痹[22]。（3）燒傷后巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)：實(shí)驗(yàn)證明[23]：兔角膜堿燒傷后，腹腔巨噬細(xì)胞的體積明顯增大，吞噬能力顯著增強(qiáng)。在燒傷后9周內(nèi)，其對(duì)異物性細(xì)胞的吞噬率及吞噬指數(shù)明顯高于燒傷前。

5結(jié)論

以上研究表明燒傷后PMN、巨噬細(xì)胞的功能發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化，其在全身炎癥反應(yīng)綜合征，燒傷后并發(fā)膿毒血癥，多器官功能衰竭中都起著重要作用。弄清其功能的變化及其所帶來的影響對(duì)預(yù)防燒傷后并發(fā)膿毒血癥、多器官功能衰竭尤為重要。但目前尚缺乏有效控制或恢復(fù)燒傷后PMN、巨噬細(xì)胞功能的藥物或技術(shù)手段。一些功能改變的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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第5篇

關(guān)鍵詞：氨氯地平；氧化低密度脂蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；穩(wěn)定斑塊

中圖分類號(hào)：R972 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-1349（2012）01-0073-02

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成，是急性冠脈綜合征（ACS）最主要的發(fā)病機(jī)制［1］。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP- 9)是MMPs家族中的重要成員，是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)代謝的關(guān)鍵酶之一,在動(dòng)脈粥樣斑塊處的血管重構(gòu)、斑塊的不穩(wěn)定及破裂誘發(fā)的ACS中都起著十分重要的作用［2］。

氨氯地平（Amlodipine）是廣泛用于臨床的第三代新型長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑(calcium channel blockers,CCB)，臨床上主要應(yīng)用于高血壓治療的一線用藥。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 健康成人靜脈血液來自山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院體檢中心；人淋巴細(xì)胞分離液（Lymphocytes Separation Medium1077）為上海華精生物高科技有限公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)液；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；佛波酯購自美國SIGMA公司；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）為北京協(xié)生生物科技有限公司產(chǎn)品；FITC-CD14抗體購自日本Beckman Coulter公司。RNA提取試劑盒（TransZol）購自北京全式金生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司；引物序列由上海生工生物有限公司合成；酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒購自美國R＆D公司；氨氯地平為輝瑞公司饋贈(zèng)。

1.2 巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定 取肝素抗凝靜脈血30 mL分裝到10個(gè)離心管，用RPMI-1640液稀釋1倍并充分混勻，分別緩慢加入等比例淋巴細(xì)胞分離液于離心管中，2000 r/min離心20 min后，吸取中間環(huán)狀云霧狀淋巴細(xì)胞層，再以3 mLPBS液充分混勻，1 500 r/min離心洗滌2次；用含10%胎牛血清的RPMI-1640各5 mL將細(xì)胞吹開混勻，取細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶，每瓶4 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)至4代后于細(xì)胞指數(shù)生長期進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，以40 ng/mL的PAM無胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h～72 h，待細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞后以RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次，置于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。臺(tái)盼藍(lán)染色法測定細(xì)胞存活率。用特異性熒光素標(biāo)記的CD14細(xì)胞表面抗體行流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞鑒定。

1.3 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)共分5個(gè)組。空白對(duì)照組，不進(jìn)行任何干預(yù)，僅單獨(dú)培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞24h；ox-LDL對(duì)照組，只加入ox-LDL 100 mg/mL孵育24 h；試驗(yàn)三組分別加入100 mg/mL ox-LDL孵育2 h后，再分別加入氨氯地平低劑量0.1 μmol/L;中劑量1.0 μmol/L;高劑量10.0 μmol/L培養(yǎng)24 h。

1.4 半定量RT-PCR檢測MMP-9mRNA的表達(dá)水平

1.4.1 RNA提取 棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，每瓶加入1.0mLTrizol，依次加入氯仿、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌后略晾干，溶于25 μL DEPC中。核酸紫外分析儀檢測，根據(jù)260/280比值，所有樣品A260/A280比值1.9~2.0。并根據(jù)260 nm 的吸光度值對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行初步定量,確定樣品中RNA純度和含量。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在20 μL體系中進(jìn)行：含1 μg RNA，20 mg/L的oligo（dT）引物，1.0 mml/L dNTP，20 U Rnase抑制劑，1×Buffer，200UM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。于PCR儀上42 ℃反應(yīng)1 h，72℃滅活10 min后保存于-20 ℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) MMP-9上游引物序列為：5′-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3′；下游引物序列為：5′-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)29次；末次延伸7 min，產(chǎn)物長度為307 bp。B-actin上游引物序列：5′-CCTGAGGCACTCTTCCAG-3′,下游引物序列：5′-TCACACTTCATGATGGA-3′,產(chǎn)物大小100 bp。

1.4.4 凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物10 μL在瓊脂糖凝膠上電泳，計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Toptal軟件分析灰度值，以各條帶與β-actin內(nèi)參條帶灰度比值，代表MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測定MMP-9蛋白含量 取六孔培養(yǎng)板上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法（enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA）測定，每組重復(fù)6次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用SPSS 13.0建立數(shù)據(jù)庫,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，ox-LDL各組MMP-9 mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對(duì)照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；ox-LDL誘導(dǎo)后，不同劑量氨氯地平各組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加，MMP-9 mRNA表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 ox-LDL誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，ox-LDL對(duì)照組MMP-9蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL對(duì)照組比較，不同劑量氨氯地平組MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。 ox-LDL誘導(dǎo)后的不同劑量氨氯地平組之間比較，隨著氨氯地平劑量增加MMP-9蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）。詳見表1。

3 討 論

心血管疾病病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化，而血栓的形成與炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中的作用非常重要。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成，是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機(jī)制［1］。粥樣硬化斑塊破裂以及血栓介導(dǎo)的急性心肌梗死最重要的決定因素是斑塊的組成成分,單核巨噬細(xì)胞的聚集，以及合成MMPs的增多和/或內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物減少，是造成粥樣斑塊纖維帽厚度和抗損傷強(qiáng)度降低，斑塊穩(wěn)定性下降的重要因素［3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)致纖維帽變薄破裂，是急性冠脈綜合征臨件發(fā)生的重要原因,MMP-9是其中重要一員［4］。MMP-9由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等以蛋白酶原前體的形式從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞外，MMP-9的作用底物有明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白。MMP-9活性增強(qiáng)可導(dǎo)致膠原裂解增加［5］。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部,MMPs主要來源于激活的巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。近年來有研究發(fā)現(xiàn),在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊容易發(fā)生破裂的部位(尤其是斑塊肩部和脂質(zhì)核處) ,MMP-1、MMP-2、MMP-9 和MMP-3 活性均有增高［6］。

氧化低密度脂蛋白作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展及急性冠脈綜合征形成中占有重要的地位，在動(dòng)脈粥樣硬化中ox-LDL除了直接導(dǎo)致內(nèi)皮損傷外，還可以引起單核細(xì)胞趨化、巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞形成和細(xì)胞毒性產(chǎn)生 ,并且可以調(diào)節(jié)粥樣斑塊內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞和生長因子的合成［7］。ox-LDL 可增加單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MMP-9 的蛋白表達(dá)并增強(qiáng)其活性，是細(xì)胞功能和基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子［8］。

氨氯地平可能機(jī)制有抗氧化、抗炎、改善內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖與遷移、保持斑塊穩(wěn)定性等［9］。

本研究用ox-LDL誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞24 h后，與單核巨噬細(xì)胞組相比，MMP-9mRNA及其蛋白表達(dá)增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；ox-LDL誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞2 h后，加入不同劑量的氨氯地平，與ox-LDL空白對(duì)照組相比，MMP-9的表達(dá)減少且與氨氯地平的劑量有濃度劑量依賴關(guān)系。氨氯地平可通過抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，發(fā)揮穩(wěn)定粥樣斑塊和抗炎的作用，減少急性冠脈事件的發(fā)生，但其通過何種途徑減少M(fèi)MP-9的表達(dá)，還有待進(jìn)一步研究。

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第6篇

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）是一種重要的前炎癥因子，主要作用為抑制巨噬細(xì)胞的游走移動(dòng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強(qiáng)其黏附、吞噬作用，還能促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的生成。MIF廣泛參與機(jī)體多種生理及病理生理學(xué)反應(yīng)，包括炎性反應(yīng)、腫瘤生成和皮膚創(chuàng)傷修復(fù)等。MIF在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。近年來，隨著克隆MIF cDNA的成功及其結(jié)構(gòu)的闡明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎癥性疾病中的重要作用已日益為人們所重視。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由親心肌病毒感染所致以心肌炎癥病變?yōu)橹鞯募膊。琈IF是一種重要的促炎因子，MIF在VMC發(fā)病機(jī)制及治療中的作用成為目前研究的熱點(diǎn)。因此，本文將MIF的最新進(jìn)展及其與VM的關(guān)系作一綜述。

1 MIF的細(xì)胞和組織學(xué)來源

MIF既產(chǎn)生于激活的T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及腦垂體前葉，也產(chǎn)生于多種組織細(xì)胞，哺乳動(dòng)物的MIF mRNA和蛋白廣泛表達(dá)于各種各樣的造血細(xì)胞、中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞、具有內(nèi)分泌和外分泌功能的上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、表皮細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚角質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺、前列腺及等[1]。單核巨噬細(xì)胞是血液中MIF的主要來源。

2 MIF的膜受體

細(xì)胞因子通常需要與其相應(yīng)的受體結(jié)合，活化信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮生理作用。目前大量研究證實(shí)MIF激活絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/ERK2）傳導(dǎo)通路，而對(duì)其激活方式是受體依賴型還是非受體依賴型的研究也是近年來的熱點(diǎn)。2003年Leng等[2]研究發(fā)現(xiàn)，CD74是MIF的可能膜受體。MIF可能通過與細(xì)胞膜表面蛋白CD74的細(xì)胞外基團(tuán)結(jié)合而發(fā)揮作用。CD74為MHCⅡ類相關(guān)恒定鏈，是一種跨膜蛋白。MIF與CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸殘基高親和力結(jié)合后，激活ERK磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而引起各種細(xì)胞的增生及炎性介質(zhì)的合成與釋放，產(chǎn)生各種生理效應(yīng)，而兩種抗CD74抗體（LN2或M-B741）可明顯阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗體均可抑制細(xì)胞膜上的CD74分子與MIF的結(jié)合，從而阻抑MIF的促炎作用。

3 MIF的基因與蛋白結(jié)構(gòu)

人類基因組中MIF定位于21號(hào)染色體(21q22，3)，為單拷貝基因。但在小鼠基因組中，則是由10個(gè)以上假基因組成的多拷貝基因，定位于10號(hào)染色體上。MIF的基因較小，人和小鼠的MIF mRNA長度大約為0.8 kb。1995年，美國Duke大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Picower醫(yī)學(xué)研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全長約2 119 bp，其編碼區(qū)由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，啟動(dòng)子區(qū)域有幾個(gè)保守的DNA序列可以和轉(zhuǎn)錄因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP結(jié)合元件反應(yīng)蛋白等結(jié)合，從而受其調(diào)控。在MIF cDNA序列中，第173位堿基G或C的變化構(gòu)成了MIF的單核苷酸多態(tài)性。MIF蛋白結(jié)構(gòu)獨(dú)特，為α/β結(jié)構(gòu)，以同源三聚體形式存在，通過單體內(nèi)的β2片層及α2螺旋C末端之間氫鍵相互作用加以穩(wěn)定[3]。人和嚙齒類動(dòng)物MIF蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)為115位氨基酸殘基，相對(duì)分子量為12.5 kD。不同種動(dòng)物的MIF蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的為大鼠和小鼠的MIF蛋白質(zhì)，僅差1個(gè)氨基酸，人和小鼠的同源性也高達(dá)90%。人和大鼠的MIF蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)基本相似，差別僅在于C末端的11氨基酸堿基上。

4 MIF的生物學(xué)功能

4.1 免疫調(diào)節(jié)功能：MIF是先天性免疫和獲得性免疫的重要調(diào)節(jié)因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系統(tǒng)和應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中不可缺少的成員。在免疫過程中，MIF不僅有抑制巨噬細(xì)胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，還促進(jìn)其在炎癥局部浸潤、增生、激活及通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)某些細(xì)胞因子的表達(dá)，分泌細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同時(shí)使NO釋放增加和磷脂酶A2的表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗體則對(duì)過度炎癥反應(yīng)具有顯著的保護(hù)作用；反義MIF可以下調(diào)Toll蛋白樣受體4-LPS受體復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，減少Gˉ細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生，同時(shí)負(fù)性調(diào)節(jié)NF-κB調(diào)節(jié)的相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。

4.2 對(duì)腫瘤的作用：有報(bào)道發(fā)現(xiàn)肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌以及顱咽管瘤等細(xì)胞上有MIF mRNA及蛋白表達(dá)，并且多數(shù)呈高表達(dá)[6]。進(jìn)一步研究可證實(shí)轉(zhuǎn)移生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上調(diào)MIFmRNA及蛋白表達(dá)，說明MIF可直接或通過協(xié)助其它生長因子而間接地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。近期又有發(fā)現(xiàn)，抗MIF抗體可有效地抑制腫瘤細(xì)胞在淋巴細(xì)胞系和血管內(nèi)皮細(xì)胞系中的生長及新血管的形成，從而有效地減慢腫瘤的生長速度。另外，有研究提示，癌細(xì)胞的MIF高表達(dá)可能影響了腫瘤細(xì)胞間的黏附性，使腫瘤細(xì)胞更加容易相互分離移動(dòng)，并向周圍鄰近組織侵襲，從而促進(jìn)惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。目前，關(guān)于MIF促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制還不清楚，有研究認(rèn)為MIF對(duì)抑癌基因P53的抑制作用可能與其致癌作用有關(guān)[7，8]。另外，MIF也可以通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá)增加，從而促進(jìn)癌細(xì)胞向淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。

4.3 神經(jīng)內(nèi)分泌功能：MIF作為垂體激素和糖皮質(zhì)激素的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。某些促甲狀腺素垂體細(xì)胞通過下丘腦-垂體-腎上腺軸起始宿主應(yīng)答時(shí)伴有MIF的釋放，在下丘腦切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后發(fā)現(xiàn)垂體細(xì)胞釋放MIF的量與血清中MIF的量基本接近。在下丘腦-垂體-腎上腺軸受刺激后，垂體以“激素樣”方式分泌MIF。MIF可能是一種對(duì)糖皮質(zhì)激素起負(fù)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。

4.4 酶學(xué)功能：MIF能催化互變異構(gòu)反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，具有3種催化活性作用[9]：為多巴色素異構(gòu)酶；羥苯丙酮酸互變異構(gòu)酶，能催化羥苯丙酮和羥苯丙酮酸的酮基-烯酸的互變異構(gòu)；谷光甘肽（GSH）和二羥酯酰胺作為MIF生理性氧化還原底物，并且它還作為一種新型蛋白質(zhì)-巰基氧化還原酶參與氧化還原反應(yīng)。但MIF明確的生理和病理生理功能與催化特性間的關(guān)系并未確定。

4.5 損傷修復(fù)功能：有研究發(fā)現(xiàn)在角膜損傷的愈合過程中，伴隨著角膜細(xì)胞浸潤和內(nèi)皮細(xì)胞的分化，MIFmRNA的表達(dá)水平也相應(yīng)增加。隨后發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮膚損傷愈合過程中，MIF表達(dá)有增加趨勢，而應(yīng)用抗MIF抗體可推遲損傷的愈合。近期Mitchell 等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纖維細(xì)胞的增殖，MIF的這種促增殖效應(yīng)與P44/P42有絲分裂原激活的蛋白激酶的活性有關(guān)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)MIF可通過蛋白激酶A來調(diào)節(jié)胞質(zhì)中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF還可逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對(duì)胞質(zhì)中磷脂酶A2的抑制作用，

5 MIF與VM

VM是臨床較常見的疾病之一，患病率達(dá)21.83/10萬，且年齡越小，發(fā)病率越高。病毒感染后所致的心臟炎癥可累及心肌細(xì)胞、間質(zhì)組織、血管成分及心包，而導(dǎo)致急性、亞急性和慢性病變。VM急性期可引起心衰、心律失常等癥狀，極少數(shù)患者因嚴(yán)重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎癥持續(xù)，轉(zhuǎn)為慢性心肌炎，出現(xiàn)進(jìn)行性心臟擴(kuò)大、心功能減退、頑固性心律失常，經(jīng)過數(shù)年或更長時(shí)間后死于并發(fā)癥。引起VM的病原體有20余種，但最常見的為柯薩奇病毒B組（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM與之有關(guān)，其次為腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，目前多數(shù)認(rèn)為是病毒直接損害和免疫變態(tài)反應(yīng)所致。目前臨床上VM常采用支持治療、中藥、抗心力衰竭和抗病毒藥物、免疫抑制劑等治療方法，但療效欠佳，部分預(yù)后不良[10]。因此，深入研究該病的發(fā)病機(jī)制，闡明其病理生理過程，尋找有效的藥物治療和生物治療靶點(diǎn)，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

近年來VM發(fā)病率呈增長趨勢，現(xiàn)已知CVB是VM的主要病原，并認(rèn)為CVB誘導(dǎo)的心肌炎可能在感染過程中依賴細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞因子在VM發(fā)病機(jī)制中占有主導(dǎo)地位。MIF是新發(fā)現(xiàn)的一種多效型細(xì)胞因子，是一種重要的前炎癥因子，由單核巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生，其主要作用為抑制巨噬細(xì)胞的游走移動(dòng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、聚集、增生、活化，增強(qiáng)其黏附、吞噬作用，此外，還能促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多種細(xì)胞因子的生成，從而間接增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，參與機(jī)體炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到廣泛關(guān)注。Matsui等[11]在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎中發(fā)現(xiàn)，心肌組織MIF mRNA和蛋白水平明顯增加，此外，血清MIF濃度也顯著升高，而通過MIF中和抗體阻斷MIF的表達(dá)則可以明顯減輕心肌的病變程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管細(xì)胞間黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表達(dá)。同樣，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨細(xì)胞性心肌炎時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)注射MIF中和抗體后，心肌炎癥病變也顯著減輕。郭富強(qiáng)等[13]的研究亦發(fā)現(xiàn)，MIF在柯薩奇病毒性心肌炎小鼠心肌表達(dá)上調(diào)，與心肌損害程度密切相關(guān)。張小佛等[14]報(bào)道急性VM患兒血清MIF水平明顯升高，并與CK-MB呈正相關(guān)。這些研究提示，MIF可能與VM的形成有密切關(guān)系，有望成為治療和預(yù)防VM的一種關(guān)鍵靶分子。

6 展望

MIF作為機(jī)體的一種多效性的細(xì)胞因子，在炎癥應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，近年來其在VM發(fā)生中的致病作用倍受人們關(guān)注。盡管目前對(duì)其致病機(jī)制還不完全清楚，但MIF的中和抗體已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床上取得較好的療效，另外，其他拮抗MIF的藥物也相繼被發(fā)現(xiàn)，如維生素E和西替利嗪等。因此，隨著研究的深入，針對(duì)MIF的干預(yù)治療將為臨床治療VM提供一個(gè)新的思路和方法。

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第7篇

最初發(fā)現(xiàn)MIF在先天性免疫和獲得性免疫過程中起重要作用。既能活化淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，又能抑制糖皮質(zhì)激素的生理作用，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制MIF可改善自身免疫性疾病大鼠模型的病情進(jìn)展；此外，值得注意的是MIF在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，這使得MIF極可能成為治療自身免疫病及腫瘤的新靶點(diǎn)。很多研究表明MIF與急性胰腺炎、炎性腸病、川崎病、哮喘、膿毒癥等炎癥性疾病及胃癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤密切相關(guān)，本文將對(duì)其分子機(jī)制做一綜述。

1MIF在細(xì)胞中的分子作用機(jī)制

MIF由115個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為12.5kd，二級(jí)結(jié)構(gòu)與主要組織相容性抗原（MHC）高度相似，由兩個(gè)反向平行的α螺旋和六個(gè)β折疊構(gòu)成。MIF的活性形式是由三個(gè)同源單體構(gòu)成的三聚體與D-多巴色素互變異構(gòu)酶高度同源。這種獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)使其具有異構(gòu)酶活性，它的羧基末端是其酶學(xué)活性的關(guān)鍵并能穩(wěn)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。已合成多種MIF抑制劑，ISO-1抑制MIF互變異構(gòu)酶活性及其細(xì)胞因子活性，抑制內(nèi)毒素大鼠巨噬細(xì)胞TNF的釋放，降低其死亡率；Mitchell等[2]合成了一種效用強(qiáng)于ISO-1的小分子量MIF抑制劑4-IPP，能不可逆性抑制MIF異構(gòu)酶活性，尤其是在癌癥組織中。

最初認(rèn)為MIF由T淋巴細(xì)胞分泌作用于巨噬細(xì)胞，然而接下來的研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等大多數(shù)炎性細(xì)胞均表達(dá)MIF，并在宿主防御反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。大多數(shù)上皮細(xì)胞表達(dá)并儲(chǔ)存MIF，鑒于上皮細(xì)胞是阻擋病原體的第一道屏障，MIF的存在提示其在早期固有免疫中起重要作用。有趣的是MIF在腺垂體中被檢測到，特別是在分泌ACTH的細(xì)胞內(nèi)，在此MIF的分泌遵循晝夜節(jié)律，并與皮質(zhì)類固醇的分泌峰值相一致。從在不同組織細(xì)胞中的分布情況看，MIF很可能不僅在機(jī)體免疫防御方面起重要作用，還有其他生理功能未被闡明。

盡管MIF在多種免疫細(xì)胞中的作用已經(jīng)知曉，但科學(xué)家花了很長時(shí)間研究它所參與的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。試驗(yàn)表明MIF信號(hào)傳導(dǎo)途徑的受體CD74為一種II型跨膜蛋白，在巨噬細(xì)胞CD74與MIF結(jié)合具有高度親和力，這種復(fù)合物介導(dǎo)胞外MAPK活性及細(xì)胞增殖。此外CD44作為MIF的復(fù)合跨膜受體協(xié)同引發(fā)ERK1和ERK2激酶磷酸化，MIF與CD74和CD44受體絲氨酸磷酸化有關(guān)，進(jìn)一步能夠抑制細(xì)胞凋亡[3]。Bernhagen J等[4]研究認(rèn)為MIF競爭性結(jié)合功能性受體CXCR4和CXCR2，形成CXCR2-CD74-MIF復(fù)合物誘發(fā)單核細(xì)胞聚集于動(dòng)脈粥樣硬化炎性病變處，可實(shí)測到快速整合蛋白及鈣離子內(nèi)流。而MIF缺陷大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型可見單核細(xì)胞聚集明顯減少。作者認(rèn)為MIF具有趨化因子樣功能調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞募集。MIF與受體結(jié)合后，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)ERK-MAP信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過細(xì)胞周期蛋白D1轉(zhuǎn)錄和Rb基因磷酸化促進(jìn)細(xì)胞增殖。在此快速短暫級(jí)聯(lián)反應(yīng)中還有另外一條通路，MIF與蛋白Jab-1/CSN5在胞內(nèi)結(jié)合，絲氨酸激酶起重要作用并加快細(xì)胞周期[5]。

2MIF與炎癥

MIF最初被發(fā)現(xiàn)于研究IV型遲發(fā)型免疫反應(yīng)的細(xì)胞上清液中。結(jié)核菌素注射引發(fā)的炎性細(xì)胞浸潤的巨噬細(xì)胞亦產(chǎn)生MIF，與對(duì)照組比較MIF抗體明顯減輕過敏反應(yīng)及炎性細(xì)胞浸潤。因此，MIF被認(rèn)為是一種促炎性細(xì)胞因子。這種觀點(diǎn)進(jìn)一步在感染性休克大鼠模型上得到證實(shí)，注射內(nèi)毒素之后MIF的分泌及蛋白合成明顯增加，然而加入重組MIF后這種效應(yīng)被減弱。利用反義MIF可抑制MIF及TNF α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這表明MIF具有自分泌功能以抑制類固醇效應(yīng)及部分細(xì)胞因子的生成[6]。在多種炎性組織中均檢測出MIF分泌增多，然而破壞MIF功能能否減輕炎癥反應(yīng)及疾病預(yù)后，各項(xiàng)研究成果有所沖突。

Bacher 等報(bào)道MIF能夠影響T細(xì)胞的增殖與活性。隨后發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞不僅是MIF的效應(yīng)細(xì)胞也是MIF的分泌細(xì)胞，而MIF增強(qiáng)TNF及IFN的表達(dá)，這種自分泌的形式加快了細(xì)菌自感染病灶的遷移，并且能夠減少中性粒細(xì)胞的凋亡[6]。Roger等[6]一系列實(shí)驗(yàn)研究表明MIF作用于巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞的TLR-4（Toll-like receptor 4），后者則是內(nèi)毒素受體。MIF基因敲除大鼠僅低表達(dá)這種受體，這或許能夠解釋內(nèi)毒素對(duì)這種大鼠相對(duì)較低的致死率。

當(dāng)機(jī)體處于“應(yīng)急”或免疫反應(yīng)時(shí)，腎上腺釋放糖皮質(zhì)激素，后者可以削弱Th1及單核巨噬細(xì)胞的活化，抑制促炎細(xì)胞因子的釋放和PLA2的合成，減輕炎癥反應(yīng)。另一方面，腺垂體和單核巨噬細(xì)胞又合成大量的MIF，MIF又可促使巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，兩者的分泌可相互促進(jìn)。這提示MIF和下丘腦垂體腎上腺軸有直接的因果關(guān)系，具有拮抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用。這種相互拮抗作用提示有某種潛在機(jī)制避免炎癥反應(yīng)過度化[7]。Attila Paszt等應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及其拮抗劑干預(yù)AP大鼠模型示MIF是急性胰腺炎發(fā)病過程中的一個(gè)關(guān)鍵性炎癥因子，糖皮質(zhì)激素在其導(dǎo)致的多器官損害中發(fā)揮重要作用[8]。

多項(xiàng)研究表明MIF在特應(yīng)性皮炎、哮喘、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種炎性疾病中高表達(dá)。Otukesh等[9]對(duì)小兒尿路感染的臨床研究顯示MIF可作為鑒別膀胱炎與腎盂腎炎的一項(xiàng)重要指標(biāo)，并且是永久性腎損害的危險(xiǎn)因素。Santos等[10]研究認(rèn)為MIF作為一種多效性促炎性細(xì)胞因子在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有多個(gè)細(xì)胞靶點(diǎn)，通過MAP激酶及ERK激酶信號(hào)通路活化T細(xì)胞，促進(jìn)特異性免疫反應(yīng)，與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。J.Wu等[11]研究認(rèn)為MIF具有多態(tài)現(xiàn)象，因基因啟動(dòng)子在不同炎性疾病中表達(dá)不同，并證實(shí)MIF-173G/C與小兒哮喘密切相關(guān)。在DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中MIP-1及MCP-1表達(dá)顯著增加，活體研究發(fā)現(xiàn)MIF調(diào)節(jié)MIP-1及MCP-1的表達(dá)，MIF缺陷大鼠炎性改變明顯減輕，揭示MIF在自身免疫性腸病的發(fā)病起關(guān)鍵作用[12]。

3MIF與腫瘤

目前認(rèn)為，MIF作為一種獨(dú)特的細(xì)胞分泌因子，不僅可以參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，而且MIF 還在多種腫瘤細(xì)胞，癌前病變中都過表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]，和細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及腫瘤血管生成等關(guān)鍵環(huán)節(jié)密切相關(guān)[14]。

有研究證明，靶向沉默MIF基因后，肺腺癌A549細(xì)胞的侵襲與遷移能力下降90%，若MIF過表達(dá)，則可觀察到相反現(xiàn)象[14]。MIF參與了肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生和發(fā)展，研究表明：NSCLC 肺癌組織標(biāo)本高表達(dá)MIF與血中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 和肺癌組織CXC趨化因子表達(dá)升高呈正相關(guān)，特別是與腫瘤組織微血管密度呈顯著正相關(guān)。McClelland等[15]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織標(biāo)本異的MIF受體－CD74 表達(dá)同樣顯著增高且誘導(dǎo)體內(nèi)外促血管新生的CXC趨化因子表達(dá)升高；MIF 這種誘導(dǎo)血管新生效應(yīng)可被CD74 抗體所拮抗；侯俊娜等[16]研究表明：大細(xì)胞肺癌H460 細(xì)胞株高表達(dá)MIF蛋白，體外應(yīng)用siRNA 靶向沉默MIF基因后，H460 細(xì)胞的活性、增殖能力下降; 繼而用AnnexinV-FITC / PI 雙染色凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MIF siRNA 部分阻斷MIF 表達(dá)后，H460 細(xì)胞凋亡率顯著增加。上述結(jié)果均提示MIF 與NSCLC血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。大量研究表明，MIF 通過抑制抑癌基因p53 的功能、持續(xù)激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、誘導(dǎo)環(huán)氧化酶(COX)/前列腺素E2(PGE2) 激活、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及分化等獨(dú)特的生物學(xué)作用多層次促進(jìn)腫瘤的生長、增殖及侵襲[17]，并且在低分化腫瘤中，MIF表達(dá)與預(yù)后相關(guān)。Jung等[18]研究表明，MIF 阻止P53 從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，并且可抑制P53 的活性，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。Binsky等[19]在慢性淋巴細(xì)胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，MIF表達(dá)明顯升高，通過激活I(lǐng)L -8，繼而Bcl-2表達(dá)增加，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Arenberg等[20]發(fā)現(xiàn)，在C57BL /6 小鼠肺損傷急性期，MIF表達(dá)增加，抑制在急性期注入小鼠體內(nèi)的Louis 癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖，而在敲除MIF基因的小鼠中則無此現(xiàn)象。

最新研究報(bào)道，在單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高爾基體蛋白p115和MIF都有表達(dá)，且在細(xì)胞質(zhì)中p115能夠調(diào)節(jié)MIF的分泌。在炎癥刺激下，單核細(xì)胞中p115 能從高爾基體上移位到細(xì)胞質(zhì)其他部位，游離的p115 可與細(xì)胞質(zhì)中的MIF因子結(jié)合，可將MIF 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上與其特異的CD74，CD44受體結(jié)合；也可刺激MIF 的分泌，使得上清液中的p115和MIF含量增加。p115 的這種位置變化可以產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而引起細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。在前列腺癌中免疫共沉淀結(jié)果也顯示高爾基體上的蛋白p115的羧基末端與MIF相連[21]，這表明前列腺癌細(xì)胞中p115 和MIF相關(guān)。Bucala[22]提出MIF的調(diào)節(jié)是受體為基礎(chǔ)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 可與靶細(xì)胞表面受體相互作用，CD74 是細(xì)胞膜上MIF的高親和力結(jié)合蛋白, 分布在細(xì)胞質(zhì)和胞膜上, 但是MIF不能與胞質(zhì)中的CD74結(jié)合, 只能與胞膜及膜外區(qū)域的CD74受體結(jié)合，且CD74 是一種II 型跨膜蛋白, 可啟動(dòng)向ERK /MAPK 激酶傳導(dǎo)依賴的M IF信號(hào), 有研究報(bào)道MIF能短暫也可持續(xù)地激活ERK信號(hào)通路, 與細(xì)胞增殖, 分化相關(guān)[23]。MIF結(jié)合到CD74-CD44復(fù)合體, 導(dǎo)致CD74-ICD釋放, 通過Sky和Akt激活NF-B, 促進(jìn)B細(xì)胞DNA合成, 進(jìn)入S期, 細(xì)胞分裂, Bcl-XL 和Bcl-2轉(zhuǎn)錄增加, 細(xì)胞存活。何興祥等[24]實(shí)驗(yàn)表明靶向MIF的siRNA可以促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的凋亡, 可能的機(jī)制是MIF siRNA抑制MIF的表達(dá), 導(dǎo)致CD74 的表達(dá)下降, Caspases8和Caspases3表達(dá)增加誘導(dǎo)凋亡增加。易永芬等[25]研究指出胃癌及肝癌中P115和MIF的表達(dá)呈正相關(guān), P115在腫瘤中表達(dá)的增加影響MIF的表達(dá)和分泌, 改變其在細(xì)胞內(nèi)空間位置, 使得MIF能夠與細(xì)胞膜及胞外的CD74受體結(jié)合,活化MAPK途徑, 導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，MIF在炎癥性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，有望成為疾病早期診斷預(yù)測疾病進(jìn)展和治療預(yù)后的生物靶標(biāo)。一些小分子MIF抑制劑已被合成并進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

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第8篇

學(xué)意義; 甘露糖不能誘導(dǎo)Mφ分泌TNFα與IL4。結(jié)論: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通過甘露糖受體介導(dǎo)， 而APS的作用不僅僅與甘露糖受體有關(guān)。兩種多糖與甘露糖受體的作用差異可能與其單糖組成密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞 甘露糖受體 大黃多糖 當(dāng)歸多糖 腫瘤壞死因子 白細(xì)胞介素4

許多中藥多糖能夠刺激巨噬細(xì)胞（Macrophage， Mφ）釋放前炎癥因子或者某些細(xì)胞因子， 推測其可能機(jī)制與Mφ膜上的模式識(shí)別受體（pathogen recognition， PRR）結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路的活化有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)歸多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟， 增強(qiáng)抗原提呈能力［1， 2］; 促進(jìn)脾細(xì)胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能夠?qū)菇Y(jié)腸炎大鼠CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高結(jié)腸炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反應(yīng)作用機(jī)制， 尚不清楚。

Mφ是體內(nèi)特定的吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞， 是連接先天免疫系統(tǒng)及后天免疫系統(tǒng)的橋梁。其表面眾多膜受體參與完成這些功能， Mφ甘露糖受體(Macrophage Mannose receptor， MMR)為其中之一。研究表明， MR是一種PRR， 可特異性地識(shí)別以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或巖藻糖為末

端的配體并與之結(jié)合［6］， 這些配體可來源于內(nèi)源性或外源性分子。推測MR在病原體的識(shí)別、 吞噬與清除， 在結(jié)核、 腫瘤、 感染等許多疾病過程中都發(fā)揮著重要的作用。我們的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 組分RTP1， RTP2所含單糖比例不同; APS則含有N乙酰

葡糖胺殘基［1］， 組分APS1， APS2， APS3所含單糖比例也不同。這兩種多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過MMR而起效的。本研究將探討APS混合組分、 RTP混合組分對(duì)Mφ吞噬及分泌細(xì)胞因子的影響， 以揭示兩種中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供， 動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)， 溫度22±2℃， 相對(duì)濕度50%～60%， 自動(dòng)調(diào)控晝夜各12 h， 顆粒飼料喂養(yǎng)， 自由飲水。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司， 胎牛血清購自杭州四季青公司生物制品廠， PBS緩沖液購自博士德生物工程公司， 甘露糖購自上海試劑二廠; 半乳糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; APS及RTP由我實(shí)驗(yàn)室提供， EDTA以及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 購自Sigma公司; GENios pro多功能酶標(biāo)儀為瑞士TENCN公司產(chǎn)品; Nikon H600L熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 腹腔Mφ的分離、 純化及培養(yǎng)

取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮膚， 打開腹壁， 但勿傷及腹膜。用注射器向腹腔內(nèi)注入PBS 10 mL， 輕揉腹腔5 min， 剪開腹膜， 用吸管吸取腹腔內(nèi)液體， 注入離心管， 1 000 r/min 離心5 min。棄上清， 分別加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 吹打混勻后計(jì)數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個(gè)/L， 分別接種腹腔Mφ于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。3 h后輕輕吸棄培養(yǎng)液后， 再用PBS洗去未貼壁細(xì)胞， 重復(fù)3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 用姬姆薩瑞氏染色法染色， 觀察Mφ占 95％以上［8］。純化后的單層大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃ 50

mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察MFITCBSA與Mφ的結(jié)合能力

取純化腹腔Mφ， 以每孔1×106個(gè)腹腔Mφ接種于底部覆蓋玻片的6孔培養(yǎng)板， 純化后分為3組: 空白對(duì)照組（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS緩沖液）; ManFITCBSA陽性對(duì)照組（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA實(shí)驗(yàn)組（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用錫鉑紙包嚴(yán)培養(yǎng)板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS沖洗接種有Mφ的蓋玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蠟封片， 4℃短時(shí)儲(chǔ)存留待觀察。熒光顯微鏡激發(fā)光譜495 nm， BA520阻擋濾光片， DM505二向分色濾光片。

1.2.3 多糖對(duì)Mφ吞噬ManFITCBSA的影響

取純化腹腔Mφ， 以每孔1×104個(gè)接種于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS沖洗3遍， 分別加入不同濃度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合組分、 RTP混合組分以及ManFITCBSA， 每組3個(gè)孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 棄上清， PBS沖洗3遍， 重復(fù)3次［9］。

1.2.4 多糖對(duì)Mφ分泌細(xì)胞因子的影響

取純化Mφ， 以每孔1×104個(gè)腹腔Mφ接種于Costar96孔培養(yǎng)板， 分別與APS、 RTP、 Man、 APS+ Man

、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)36 h， 取細(xì)胞上清按照試劑盒說明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）測定細(xì)胞因子水平。簡述如下: 在酶標(biāo)板加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 在反應(yīng)孔中加入待測樣品的Mφ培養(yǎng)液上清各100

μL， 然后加入100 μL生物素標(biāo)記抗體， 37℃反應(yīng)1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL親和素過氧化物酶復(fù)合物（ABC）， 37℃反應(yīng)30 min， 洗板5次， 加入TMB顯色液， 避光反應(yīng)10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm測定光吸收值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示， 利用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析， 顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)及SNKq檢驗(yàn)， P

2 結(jié)果

2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用熒光顯微鏡觀察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情況(圖1A)， 通過競爭抑制試驗(yàn)觀察到: D甘露糖可以抑制該現(xiàn)象(圖1B)。

2.2 多糖對(duì)Mφ吞噬功能的影響

采用多功能酶標(biāo)儀檢測Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 在37℃時(shí)， Mφ吞噬活性與ManFITCBSA濃度呈正相關(guān)， 在4℃時(shí)， ManFITCBSA與Mφ為非特異性吸附， 熒光強(qiáng)度不隨ManFITCBSA濃度改變而發(fā)生變化（圖2）; ManFITCBSA與MMR的結(jié)合為Ca2+依賴性， EDTA可阻斷該過程（圖3）， 其阻斷能力與EDTA濃度呈正

相關(guān); 甘露糖作為MR的阻斷劑， 也阻斷該過程， 其拮抗能力與甘露糖濃度相關(guān)， 半乳糖則不能阻斷MR介導(dǎo)的Mφ對(duì)ManFITCBSA的吞噬作用（圖4）; APS、 RTP均可阻滯Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈劑量依賴性(圖5、 6)。

2.3 多糖刺激Mφ釋放TNFα， IL4的測定

采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNFα和IL4水平， 體外將APS和RTP與Mφ共孵育36 h， 可以促進(jìn)正常腹腔Mφ分泌TNFα(圖6)， 與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

我們已發(fā)現(xiàn)， RTP與APS均具有免疫調(diào)節(jié)作用， 但它的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)證明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫調(diào)節(jié)作用可能通過MR介導(dǎo)。

許多中藥多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反復(fù)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)存在， 與MR具有比MRmAb更高的結(jié)合特性［10］。如殼寡糖可通過Mφ表面的MR， 產(chǎn)生白介素1β和TNFα［11］; 海帶多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 對(duì)S180腫瘤細(xì)胞有較好的殺傷作用［12］。我們的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS則含有N乙酰葡糖胺殘基， 因此， RTP、 APS具有潛在的MR結(jié)合特性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， RTP與APS均可以阻斷MR介導(dǎo)的Mφ吞噬作用， 且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系， 為兩種多糖作用于MR提供了依據(jù)。

為了進(jìn)一步研究兩種多糖與MR的作用， 我們發(fā)現(xiàn)RTP和APS均可以促進(jìn)Mφ分泌細(xì)胞因子TNFα， 而MR的拮抗劑甘露糖可完全阻斷RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 說明RTP是通過MR而起作用; 甘露糖則沒有該作用; RTP和APS對(duì)Mφ分泌細(xì)胞因子IL4無明顯影響， 揭示RTP和APS影響Mφ的免疫功能主要通過Th1型細(xì)胞免疫發(fā)揮作用， 同時(shí)提示我們以前實(shí)驗(yàn)中RTP和APS影響T細(xì)胞極化可能通過MR起作用。

參考文獻(xiàn)

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［10］Schepetkin IA， Quinn MT. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(3): 317-333.

第9篇

關(guān)鍵詞：KLF4；基因轉(zhuǎn)染；R8w264.7細(xì)胞；C2C12細(xì)胞；細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào)：R361　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A　文章編號(hào)：1007－7847(2007)03－0263－05

Kruppel樣因子4(Kruppel-1ike factor4，KLF4)是Sp/Kdlppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，這個(gè)家族目前已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)成員，如Spl-4、KLPl-14等，Sp/Kruppel樣因子是機(jī)體內(nèi)一類具有重要功能的蛋白質(zhì)，它們參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等重要生命過程，并與腫瘤等多種疾病有關(guān)，研究表明，KLF4在胚胎發(fā)育晚期及腸管分化終末期的上皮細(xì)胞中其表達(dá)均增高，提示KLF4具有抑制某些細(xì)胞增殖的功能，為了深入探討KLF4的功能，本研究室建立了穩(wěn)定高表達(dá)該基因的Raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞株和C2C12小鼠肌原細(xì)胞株，在此建株過程中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染KLF4對(duì)上述兩種細(xì)胞增殖的影響明顯不同。

1　材料和方法

1．1　材料

Raw264.7巨噬細(xì)胞株購自上海細(xì)胞中心；C2Cn小鼠肌原細(xì)胞由本校細(xì)胞中心提供：DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibeo公司；G418購自Promega；無支原體小牛血清，杭州四季青生物工程公司產(chǎn)：丙烯酰胺、N，N′2亞甲基雙丙烯酰胺購自Fluka公司；二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸胺、TEMED、硝酸纖維素膜購自Promega公司；Lipo-feetamineTM 2000、真核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1購自Invitrogen life technologies公司：peDNA3.1-KLF4重組質(zhì)粒本室構(gòu)建；兔抗KLF4多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG及DAB顯色試劑盒購自博士德生物工程有限公司：CCK-8溶液由日本同仁化學(xué)株式會(huì)社提供。

1．2　方法

1．2．1　KLF4過表達(dá)細(xì)胞株的建立

利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)(根據(jù)Invitrogenlife technologies公司提供的轉(zhuǎn)染操作說明書進(jìn)行操作)將空載體pcDNA3.1和重組質(zhì)粒pcDNA3.1-KLF4導(dǎo)人Raw264.7和C2C12細(xì)胞中，根據(jù)本室以往所建立的方法篩選過表達(dá)細(xì)胞株。

1．2．2　免疫印跡分析

按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所載方法進(jìn)行，用1×SDS加樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白質(zhì)，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。制備好的蛋白樣品置，80℃冰箱保存?zhèn)溆茫坑镜郎蠘?0μg蛋白，經(jīng)10％SDS-PAGE(70V，120V分別電泳2h和4h左右)電泳后，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，室溫封閉后加入兔抗KLF4多克隆抗體，室溫孵育2h，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育1h，DAB顯色，拍攝照片，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1．2．3　細(xì)胞形態(tài)觀察

取各轉(zhuǎn)染細(xì)胞于倒置顯微鏡下，觀察其生長速度和形態(tài)改變，并逐日記錄。

1．2．4　CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖

取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期各組細(xì)胞接種于96孔板(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，每組接種5個(gè)復(fù)孔，在含10％新生小牛血清的條件下分別培養(yǎng)24h，48h及72h后加入CCK-8溶液10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h，將96孔板放人酶標(biāo)儀，在450nm波長處測定各孔OD值。

1．2．5　流式細(xì)胞術(shù)檢測

本實(shí)驗(yàn)由北京鼎國生物技術(shù)公司協(xié)助完成，分別接種等量的對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞于100mL培養(yǎng)瓶中，每組5瓶，培養(yǎng)24h后，參考該公司流式細(xì)胞檢測說明收集細(xì)胞，送北京鼎國生物技術(shù)有限公司進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1．2．6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2．1　Western blotting篩選高表達(dá)KLF4的細(xì)胞克隆

采用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染KLF4的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-KLF4和空載體pcDNA3.1至Raw264.7和C2C12，細(xì)胞中，經(jīng)G418篩選后，利用KLF4多克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析，鑒定高表達(dá)克隆，結(jié)果顯示，篩選到高表達(dá)克隆，在兩種細(xì)胞株中KLF4蛋白表達(dá)量較轉(zhuǎn)空載體組明顯增加(圖1)。

2．2　細(xì)胞生長情況

2．2．1　KLF4過表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

KLF4過表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，C2C12空載體組貼壁細(xì)胞主要呈長梭形，極向或交叉排列，部分KLF4基因過表達(dá)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，如細(xì)胞向多角形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞形狀多樣等(見圖2)。

2．2．2　CCK-8法結(jié)果

Raw264.7的空載體組和KLF4組之間細(xì)胞增殖能力無明顯變化(p＞0.05)(表1)，C2C12的KLF4組與其空載體組相比較，細(xì)胞增殖能力降低(p＜0.05)(表2)。

2．2．3　流式細(xì)胞術(shù)分析KLF4對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Raw264.7-pcDNA3.1、Raw264.7-KLF4，C2C12-pcDNA3.1及C2C12-KLF4 4組細(xì)胞的周期分布及凋亡百分率，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空載體和KLF4過表達(dá)對(duì)Raw264.7細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡無明顯影響(P＞0.05)；與轉(zhuǎn)

空載體的C2C12相比較，KLF4過表達(dá)的C2C12細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞減少，而G1期的細(xì)胞相應(yīng)增多(圖3)，凋亡細(xì)胞也增多(P＜0.05)(圖4)。

3　討論

KLF4是Kriippel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)重要成員，小鼠KLF4蛋白全長包含483個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為53kD，和人的KLF4蛋白具有90％的相似性，KLF4蛋白的羧基端具有3個(gè)連續(xù)的C2H，鋅指結(jié)構(gòu)，這3個(gè)鋅指的結(jié)構(gòu)均符合保守序列：CX2-4CX3FX5LX2HX3H；兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)之間由一個(gè)7個(gè)氨基酸殘基的H/C連接序列連接，該連接序列為了GEKP(Y/F)X，KLF4能夠?qū)堑鞍?(keratin)、腸堿性磷酸酶(intestinalalkaline phosphatase，IAP)、鳥氨酸脫羧酶(omithine decarboxylase，ODC)、β鏈蛋白(β-catenin)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)等多個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行調(diào)控，從而在機(jī)體的生長和發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，對(duì)KLF4的研究最初是從胃腸道開始研究的，它的表達(dá)在生長抑制的狀態(tài)下明顯增高：此后的研究發(fā)現(xiàn)，KLF4除了在腸的不同組織中表達(dá)外，還在表皮有高水平的表達(dá)并在皮膚表皮細(xì)胞分化晚期起重要作用；KLF4缺失能導(dǎo)致皮膚屏障功能障礙從而使新生小鼠在出生后短時(shí)間內(nèi)死亡，此外，最近的研究還表明，KLF4在細(xì)胞及其支持細(xì)胞的終末分化過程中出現(xiàn)高表達(dá)，這說明KLF4可能在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中起到重要作用，但是，KLF4對(duì)Raw264.7細(xì)胞和C2C12細(xì)胞增殖的影響，目前尚未見報(bào)道。

為了闡明KLF4對(duì)Raw264.7細(xì)胞和C2C12細(xì)胞增殖的影響，本研究分別建立了KLF4過表達(dá)的Raw264.7和C2C12細(xì)胞株，并采用多種方法共同檢測了KLF4過表達(dá)對(duì)該兩種細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，KLF4過表達(dá)對(duì)Raw264.7細(xì)胞的形態(tài)和增殖無明顯影響：而KLF4過表達(dá)的C2C12細(xì)胞株中，多角形的細(xì)胞增多，細(xì)胞周期中S期的細(xì)胞相對(duì)減少，細(xì)胞增殖速度明顯減慢，由此可見，KLF4對(duì)這兩種細(xì)胞增殖的影響具有顯著的細(xì)胞差異性。

第10篇

【摘要】 目的: 克隆并構(gòu)建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒， 初步探討其表達(dá)產(chǎn)物sST2Fc融合蛋白對(duì)LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。方法: 借助RTPCR技術(shù)， 從小鼠脾臟總RNA中擴(kuò)增全長sST2 cDNA， 構(gòu)建sST2與hIgG Fc段融合基因的真核表達(dá)載體（psST2Fc）。應(yīng)用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒psST2Fc轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞， 經(jīng)G418篩選， 獲得穩(wěn)定表達(dá)sST2Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株。細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)蛋白A親和層析純化后， 采用Western blot進(jìn)行鑒定， 應(yīng)用FACS檢測sST2Fc與RAW264.7巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合情況; ELISA法檢測sST2Fc對(duì)LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌TNFα和IL6的影響。結(jié)果: 測序證實(shí)克隆和構(gòu)建的小鼠sST2Fc cDNA閱讀框序列正確， Western blot 證實(shí)sST2Fc融合蛋白的表達(dá)， sST2Fc抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子TNFα和IL6。結(jié)論: 成功構(gòu)建sST2Fc融合基因并獲得穩(wěn)定表達(dá)， sST2Fc通過與其特異性受體結(jié)合可抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 小鼠sST2Fc; 真核表達(dá); RAW264.7; TNFα; IL6

ST2 最早被認(rèn)為是由成纖維細(xì)胞分泌的一種血清免疫應(yīng)答產(chǎn)物， 隨后發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞［1］和Th2細(xì)胞［2］表面存在一種跨膜型ST2， 但其不表達(dá)在Th1細(xì)胞表面。目前證實(shí)ST2屬于IL1受體超家族成員， 但不能與IL1家族成員IL1α、 IL1β或IL1R拮抗劑結(jié)合。由于在mRNA水平剪切方式的差異， ST2基因表達(dá)產(chǎn)物以跨膜型（ST2L）和分泌型(sST2)兩種形式存在， 前者主要分布在源于造血細(xì)胞的細(xì)胞表面如肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞， 而后者主要由成纖維細(xì)胞分泌產(chǎn)生。近來研究顯示， ST2除了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答由Th1型向Th2型偏移， 還涉及到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 過敏性哮喘等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［3， 4］。我們通過構(gòu)建小鼠sST2人IgG1 Fc重組質(zhì)粒（psST2Fc）并表達(dá)可溶性ST2Fc融合蛋白， 觀察其對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的影響， 為進(jìn)一步應(yīng)用該分子治療炎癥相關(guān)性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠(8～12周齡， 雄性)由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; CHO細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心; RAW264.7巨噬細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系保藏。單克隆大鼠抗小鼠ST2抗體購自R&D公司。LPS和人IgG標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司， TRIzol試劑和脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000購自Invitrogen公司， RTPCR試劑盒購于MBI公司。各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Promega公司。Sepharose CL4B蛋白A親和層析柱購自Amersham Biosciences。DNA合成和測序由Invitrogen (上海)完成。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 采用TRIzol試劑提取BALB/c小鼠脾細(xì)胞總RNA， 經(jīng)RTPCR擴(kuò)增全長sST2 cDNA。PCR 引物的序列為: 5′AAA ACA AGC TTG GCC GCC ACC ATG ATT GAC AGA CAG AG3′和5′AAA ACG GAT CCG AGC AAT GTG TGA GGG ACA CTC CT3′。采用Hind III和BamH I分別雙酶切sST2和載體pcDNA3.1Fc， 將酶切片段sST2插入pcDNA3.1Fc載體Fc的上游， 構(gòu)建重組表達(dá)載體psST2Fc， 轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌， 篩選陽性克隆， 經(jīng)酶切和測序鑒定。

1.2.2 轉(zhuǎn)染與篩選 用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒提取重組表達(dá)載體pcDNA3.1sST2Fc， 采用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞， 同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對(duì)照。具體方法為: CHO細(xì)胞在含100 mL/L胎牛血清的DMEM中， 于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d， 細(xì)胞用2.5 g/L胰酶消化并接種于24孔培養(yǎng)板中（細(xì)胞數(shù)為1×105/孔）， 待細(xì)胞融合至70％～80％時(shí)， 按LipofectamineTM 2000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 并設(shè)空載體和未轉(zhuǎn)染組對(duì)照。培養(yǎng)48 h后， 加入G418(800 mg/L)篩選陽性抗藥克隆。

1.2.3 sST2Fc蛋白的純化及鑒定 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用Sepharose CL4B蛋白A親和層析柱純化sST2Fc融合蛋白， 純化樣品的濃度用A280吸收法測定。采用Western blot鑒定sST2Fc蛋白表達(dá)， 一抗為單克隆大鼠抗小鼠ST2抗體， HRP標(biāo)記的兔抗大鼠為二抗， ECL化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析 RAW264.7巨噬細(xì)胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中， 于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)。刺激前1 d， 將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 細(xì)胞數(shù)為2×106/孔， 次日加入LPS（1 mg/L）刺激， 同時(shí)設(shè)立LPS未處理組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞， 用預(yù)冷PBS洗滌3次， 細(xì)胞計(jì)數(shù)后分裝于流式細(xì)胞管（1×105/管）。加入Fc封閉抗體， 4℃孵育30 min， 用PBS洗滌3次， 分別加入sST2Fc（0.5 mg/L）和hIgG（0.5 mg/L）， 4℃孵育30 min， 用PBA（1×PBS， 含20 mL/L胎牛血清和1 g/L疊氮鈉）洗滌3次， 隨后加入同型對(duì)照抗體和FITC標(biāo)記的山羊抗人Fc抗體， 4℃避光作用30 min， PBS洗滌3次后， 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.2.5 RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和刺激 將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 細(xì)胞數(shù)為5×105/孔， 第2天加入sST2Fc（0.5 mg/L）或hIgG（0.5 mg/L）， 同時(shí)設(shè)未處理對(duì)照組， 混勻培養(yǎng)3 h后， 加入LPS（1 mg/L）刺激， 繼續(xù)培養(yǎng)至24 h收集培養(yǎng)上清， -80℃保存。

1.2.6 ELISA檢測 采用ELISA檢測試劑盒(eBioscience) 測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL6的水平。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以x±s表示， 采用t檢驗(yàn)， P

2 結(jié)果

2.1 重組sST2Fc表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 sST2 cDNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增， 酶切消化后， 插入pcDNA3.1Fc載體， 圖1顯示重組載體psST2Fc酶切后的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。序列測定結(jié)果表明， sST2序列與GenBank中注冊(cè)的序列完全一致(GI: 2171234)。

2.2 sST2Fc融合蛋白表達(dá)的鑒定 CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)Shepharose CL4B蛋白A親和層析純化后， Western blot分析顯示（圖2）， 在轉(zhuǎn)染psST2Fc實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)一個(gè)特異性條帶， 其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）大小約100 000， 而在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組中未出現(xiàn)特異性條帶。

圖2 sST2Fc融合蛋白在CHO細(xì)胞中的表達(dá)

A: SDSPAGE檢測蛋白A親和層析純化sST2Fc蛋白; B: Western blot鑒定ST2Fc蛋白表達(dá).2.3 sST2特異性結(jié)合RAW264.7巨噬細(xì)胞 為了檢測RAW264.7巨噬細(xì)胞表面是否存在sST2相應(yīng)受體， 用流式細(xì)胞術(shù)分析sST2的特異性結(jié)合能力。圖3顯示， 在封閉RAW264.7巨噬細(xì)胞表面Fc受體后， sST2能特異性結(jié)合于RAW264.7細(xì)胞表面， 并且其結(jié)合強(qiáng)度伴隨LPS刺激而顯著上升。

圖3 sST2特異性結(jié)合巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體

A: RAW264.7巨噬細(xì)胞表面存在特異性sST2受體. 流式細(xì)胞術(shù)檢測hIgG (點(diǎn)線) 和sST2Fc(粗線) 與巨噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合 (其中細(xì)線代表同型對(duì)照). B: LPS上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞表面sST2受體表達(dá). 巨噬細(xì)胞在LPS刺激前(點(diǎn)線)和刺激后(粗線)， sST2受體表達(dá)變化 (其中細(xì)線代表同型對(duì)照).

2.4 sST2抑制LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的TNFα和IL6 在LPS刺激下， RAW264.7細(xì)胞能上調(diào)結(jié)合sST2的能力， 故進(jìn)一步檢測sST2對(duì)LPS激活巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性影響。在sST2或hIgG預(yù)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞3 h后， 加入LPS（1 mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)至24 h， 用ELISA檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNFα和IL6的水平。結(jié)果顯示（圖4）， sST2能明顯抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子TNFα和IL6， 而hIgG對(duì)照組則無此作用（P

3 討論

在細(xì)菌裂解產(chǎn)物如細(xì)菌脂蛋白、 LPS等因素刺激下， 巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子包括IL1α/β、 IL12、 TNFα及各種炎性介質(zhì)如熱休克蛋白（HSP）、 氧自由基等， 它們?cè)谡T導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答向特異性免疫應(yīng)答偏移中發(fā)揮了重要作用［5］。廣泛性的細(xì)菌感染能引起這些炎癥物質(zhì)產(chǎn)生混亂， 最終導(dǎo)致多器官衰竭和內(nèi)毒素休克。ST2可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2型免疫應(yīng)答偏移而影響疾病的轉(zhuǎn)歸， 而且在炎性因子IL1α/β和TNFα刺激下， 成纖維細(xì)胞分泌sST2的水平上升; 經(jīng)LPS預(yù)處理的人單核細(xì)胞產(chǎn)生sST2的水平亦增加， 這些結(jié)果均提示sST2可能參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用［6］。

巨噬細(xì)胞表面與sST2特異性結(jié)合的受體及其相應(yīng)功能尚未完全清楚。雖然ST2與IL1R具有高度同源性， 但未能發(fā)現(xiàn)它與已知的IL1家族成員IL1α、 IL1β或IL1R拮抗劑結(jié)合。目前， 巨噬細(xì)胞表面特異性ST2結(jié)合蛋白的cDNA序列已被克隆鑒定， 但是由該蛋白所介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)傳遞途徑尚待明確［7］。現(xiàn)已知， ST2結(jié)合蛋白含有一個(gè)跨膜端以及由12個(gè)氨基酸短肽組成的胞內(nèi)端， 故推測它可能與巨噬細(xì)胞識(shí)別sST2并介導(dǎo)下游相應(yīng)的信號(hào)傳遞有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用重組sST2Fc融合蛋白證實(shí)RAW264.7巨噬細(xì)胞表面存在特異性的ST2結(jié)合蛋白， 并且ST2結(jié)合蛋白的表達(dá)水平在LPS刺激下顯著上升。或有可能， 與sST2結(jié)合的相應(yīng)受體是巨噬細(xì)胞表面一種未知的IL1R家族新成員， 這有待進(jìn)一步研究。

為了評(píng)價(jià)sST2在巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用， 我們檢測了sST2Fc融合蛋白對(duì)LPS激活巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性影響。結(jié)果顯示， ST2Fc融合蛋白預(yù)處理組能明顯地抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子TNFα和IL6。亦有文獻(xiàn)報(bào)道［8］， sST2能有效抑制肺泡巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNFα、 IL1和IL6的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)， 而抗炎性細(xì)胞因子IL10、 TGFβ及NO的表達(dá)水平未受影響， 從而證實(shí)sST2通過直接與細(xì)胞表面受體相結(jié)合而發(fā)揮作用， 并非通過間接途徑。并且， sST2預(yù)處理可明顯抑制巨噬細(xì)胞TLR4受體mRNA的轉(zhuǎn)錄， 這種下調(diào)LPS相應(yīng)受體信號(hào)途徑的能力， 在一程度上解釋了sST2對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。由此可見， 通過進(jìn)一步明確下調(diào)巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制， sST2有望成為一種治療內(nèi)毒素休克及炎癥相關(guān)性疾病的新途徑。

參考文獻(xiàn)

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［5］ 尹華華， 朱京慈， 李 磊. 巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性［J］. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2004， 20(4): 510-512.

［6］ Kakkar R， Lee RT. The IL33/ST2 pathway: therapeutic target and novel biomarker［J］. Nat Rev Drug Discov， 2008， 7(10): 827-40.

第11篇

【摘要】目的 觀察腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和microRNA-146a在脂多糖(LPS) 誘導(dǎo)的NR8383肺泡巨噬細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，分析二者在時(shí)間上的變化關(guān)系，探討microRNA-146a對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞接種于六孔板，貼壁后加入1 μg/mL的LPS，刺激0、3、6、12 h后離心收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞中microRNA-146a和TNF-α mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白水平的表達(dá)。microRNA-146a和TNF-α mRNA的相關(guān)性采用雙變量Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果 （1）培養(yǎng)上清液中的TNF-α蛋白在LPS刺激3 h后顯著升高［（359.80±57.54 )pg/mL，P＜0.01］，于12 h達(dá)高峰［(729.22±50.40 )pg/ml，P＜0.01］；（2）LPS刺激3 h后，細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)即達(dá)到頂峰［（67.48±24.52)倍，P＜0.01］，6 h后開始降低［（29.53±4.26)倍，P＜0.05］；（3）LPS刺激6 h后，microRNA-146a表達(dá)水平顯著增高［（5.33±0.81)倍，P＜0.01］，并且持續(xù)增高［12 h：(8.21±1.19)倍，P＜0.01］；（4）細(xì)胞中microRNA-146a的表達(dá)水平與TNF-α mRNA的含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.895，P＜0.01）。結(jié)論 在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞中， microRNA-146a的表達(dá)水平與TNF-α mRNA的含量呈負(fù)相關(guān)，推測microRNA-146a可能參與了肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)調(diào)控。

【關(guān)鍵詞】microRNA-146a；肺泡巨噬細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；炎癥

The relationship between microRNA-146a and TNF-α in lipopolysaccharide-stimulated alveolar macrophages of rats ZENG Zhen-guo,GONG Hong-han, LI Yong, NIE Zhen-yun, JIE Ke-min, ZHAN Yi-an, NIE Cheng, LIU Fen, DING Cheng-zhi, SHAO Qiang, QING Cheng, ZHU Bai-lu, QIAN Ke-jian.省略

【Abstract】Objective To determine kinetics of TNF-α and miR-146a (microRNA-146a) expressions in lipopolysaccharide (LPS)-induced NR8383 alveolar macrophages (AM) at different intervals and their relationships in order to explore regulatory effect and mechanism of miR-146a on alveolar macrophages inflammatory responses.Methods NR8383 alveolar macrophages were seeded in a 6-well plate, and stimulated with 1 μg/ml of LPS for 0 h, 3 h, 6 h and 12 h separately after 90 min. Cells were harvested and supernatant were collected 0 h, 3 h, 6 h and 12 h after incubation. The expressions of miR-146a and TNF-α mRNA in cells were detected by real-time qPCR and the levels of TNF-α protein in the supernatant of cells were assayed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation between miR-146a and TNF-α mRNA. Results ①The level of TNF-α protein in the supernatant of cell was significantly increased 3 h after LPS challenge (359.80±57.54) pg/ml (P

第12篇

【摘要】 【目的】 探討辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）表達(dá)與分泌的影響。【方法】 15只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NL， n=5）、粥樣硬化模型組（AS， n=5）和辛伐他汀含藥血清組（SIM， n=5）。通過喂養(yǎng)高脂飼料，建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型后，予辛伐他汀藥液灌胃，獲得含藥血清。分別予不同濃度含藥血清（5%、10%、20%）培養(yǎng)U937單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞24 h，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表達(dá)，以及應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【結(jié)果】與相同濃度AS組比較，5%、10%、20% SIM組U937單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性降低（P值為0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20% SIM組TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異（P值均 >0.05）。而與相同濃度AS組比較，不僅10%、20% SIM組MMP-9分泌顯著性減少（P值分別為0.009和0.001），而且10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加 （P值分別為0.017和0.001）。 【結(jié)論】 辛伐他汀可抑制單核巨噬細(xì)胞MMP-9的表達(dá)和分泌，以及促進(jìn)TIMP-1的分泌。

【關(guān)鍵詞】 辛伐他汀； 巨噬細(xì)胞； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； 金屬蛋白酶組織抑制因子-1

Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups， normal control group (NL， n=5)， atherosclerotic model group (AS， n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM， n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%， 10%， and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group， 5%， 10%， and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005， 0.041， and 0.013)， and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group， 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001)， but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.

Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定，繼而破裂導(dǎo)致血栓形成是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機(jī)制[1， 2]。斑塊脂質(zhì)核心大、纖維帽薄、巨噬細(xì)胞多是結(jié)構(gòu)性易損斑塊[3]。斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞聚集，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMP）增多，金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases， TIMP）減少，導(dǎo)致斑塊內(nèi)膠原降解，纖維帽變薄，是斑塊穩(wěn)定性下降的重要原因[4， 5]。臨床研究顯示他汀對(duì)急性冠脈綜合征治療有效，可能與改善內(nèi)皮功能、抗炎及穩(wěn)定斑塊等調(diào)脂以外的作用有關(guān)［6］，但其具體機(jī)制尚未完全明確。本研究擬觀察辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MMP-9及TIMP-1表達(dá)與分泌的影響，以探討辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、治療急性冠脈綜合征的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

雄性純種新西蘭大白兔，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。人單核白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞，購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫。辛伐他汀藥片，購自默沙東公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)溶解于蒸餾水灌胃。

RPMI 1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司。新生牛血清，購自PAA公司。佛波酯（PMA），購自Sigma公司。Trizol reagent，購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermentas公司。Taq酶購自Takara公司。PCR反應(yīng)引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1細(xì)胞上清ELISA試劑盒，購自RapidBio公司。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型建立及含藥血清制備

15只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（normal， NL）、粥樣硬化模型組（atherosclerosis group， AS）和辛伐他汀含藥血清組（simvastatin group， SIM），每組5只。正常對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)12周，其余各組予高脂飼料（1%膽固醇、10%豬油、89%普通飼料）喂養(yǎng)10周后，每組隨機(jī)處死1只，證實(shí)有大動(dòng)脈粥樣硬化形成后，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)至12周，其中SIM組于第11周起給予辛伐他汀5 mg/kg，每天1次，灌胃14 d。末次給藥前禁食12 h，給藥后1 h頸動(dòng)脈無菌取血，分離血清，同組動(dòng)物血清混勻，0.22 ?滋m濾膜過濾滅菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)

U937細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于含5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長至接近融合時(shí)傳代，2~3代后用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，接種于6孔培養(yǎng)板，加入PMA使終濃度為50 ng/mL，培養(yǎng)48 h后見懸浮生長的U937細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，伸出偽足，貼壁生長。棄去舊培養(yǎng)基，PBS液洗滌后，予不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基。分別加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥樣硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)24 h用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.4 總RNA提取

吸凈培養(yǎng)基，每孔加入1 mL的Trizol液，吹打裂解細(xì)胞，收集于無RNA酶離心管中，室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿，劇烈顛倒15 s，室溫靜置3 min，4 ℃，12 000 × g離心10 min。轉(zhuǎn)移上層水相液500 ?滋L到新的離心管，加入500 ?滋L異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 × g離心7 min。棄上清，加入1 mL無RNA酶水配制的75%酒精，振蕩混勻，4 ℃，7 500 × g離心5 min。重復(fù)酒精洗滌沉淀一遍，棄去酒精，室溫干燥5 min，融解RNA于30 ?滋L無RNA酶水中，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測定RNA含量，計(jì)算出RT-PCR所需樣品量。

1.5 RT-PCR

取總RNA1.5 ?滋g，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：95 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 45 s變性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s延伸，共35個(gè)循環(huán)，最后一次循環(huán)在72 ℃延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物用含1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Labwork成像系統(tǒng)采集圖像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′，下游引物：5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為362 bp；TIMP-1-上游引物：5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′，下游引物：5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為340 bp；β-actin-上游引物：5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′，下游引物：5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為195 bp。

1.6 ELISA測定

收集細(xì)胞上清液，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存待檢。ELISA采用雙抗體夾心法，按照說明書步驟進(jìn)行，測定細(xì)胞上清MMP-9、TIMP-1濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，三組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD-t 檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P< 0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

與相同濃度NL組相比，5%、10%、20%AS組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性增高（P值均< 0.05）。與相同濃度AS組相比，5%、10%、20%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性降低（P值分別為0.005、0.041和0.013）。與相同濃度NL組相比，5%、10%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均增高（P值分別為0.034和0.029，表1、圖1）。

不同濃度間SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.747，P=0.252）。

2.2 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響

NL組、AS組和SIM組不同濃度之間TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著差異（表2、圖2）。5%、10%和20%SIM組之間TIMP-1 mRNA的表達(dá)有顯著性差異（F= 6.498，P=0.032）。與5%SIM組相比，10%、20%SIM組TIMP-1 mRNA的表達(dá)顯著性增加（P=0.039、0.014），而10%與20%SIM組之間無顯著性差異（P=0.446）。

2.3 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白分泌的影響

與同濃度NL組比較，10%、20%AS組MMP-9分泌均顯著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異（P=0.824、0.857、0.658）。與同濃度AS組比較，5%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異（P=0.427），10%、20%SIM組MMP-9分泌顯著性減少（P=0.009、0.001，表3）。

SIM組不同濃度之間MMP-9分泌無顯著性差異（F=0.985，P=0.427）。

2.4 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞TIMP-1蛋白分泌的影響

與同濃度NL組比較，AS組TIMP-1分泌均顯著性減少（P=0.004、0.044、0.003）；與同濃度NL組比較，5%SIM組TIMP-1分泌減少（P=0.038）。與同濃度AS組比較，10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加（P=0.017、0.001，表4）。

SIM組不同濃度之間TIMP-1分泌有顯著性差異（F=6.555，P=0.031）。與5%SIM組相比，10%、20%SIM組 TIMP-1分泌均顯著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含藥血清之間差異無顯著性（P=0.456）。

3 討 論

3. 1 MMP/TIMP與動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性

急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者是易損病人[1]，通常指在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，斑塊破裂，繼而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有報(bào)道[7-9]冠脈“罪犯”病變處多是軟斑塊、以正性重構(gòu)為主，常伴血栓形成。斑塊內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，導(dǎo)致斑塊中膠原含量減少，纖維帽變薄，是影響斑塊穩(wěn)定的重要因素。斑塊破裂常發(fā)生在富含單核巨噬細(xì)胞的斑塊肩部，此處巨噬細(xì)胞可分泌大量MMP，促進(jìn)纖維帽降解[10]。MMP-9，又稱明膠酶B，是巨噬細(xì)胞分泌的主要基質(zhì)金屬蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已發(fā)現(xiàn)有4種：TIMP-1～TIMP-4，它們均可與激活的MMP 呈1 ∶ 1結(jié)合，從而使MMP失活。用免疫組化方法檢測動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3顯著性增多，且多存在于斑塊肩部的巨噬細(xì)胞、纖維帽和脂核內(nèi)，與MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脈綜合征患者存在著由炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的以MMP-9升高為主的MMP-9/ TIMP-1失衡狀態(tài)[2]。因此MMP與TIMP之間的平衡，對(duì)斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)具有重要意義。研究還表明[12]，MMP-9在轉(zhuǎn)錄水平上受多種細(xì)胞因子、生長因子及活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)，而TIMP的表達(dá)很少受細(xì)胞因子和生長因子的影響。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法觀察到，與同濃度NL組相比較，5%、10%和20%AS組U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)均顯著性增高（P值均< 0.05）。這可能是因?yàn)橹鄻佑不逯泻休^高的低密度脂蛋白膽固醇，以及大量激活的炎性細(xì)胞因子、生長因子以及其他活性物質(zhì)，促進(jìn)MMP -9的表達(dá)。與相同濃度NL組比較，AS組TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異，但TIMP-1的分泌均顯著性減少（P< 0.05），提示動(dòng)脈粥樣硬化血清不但可使巨噬細(xì)胞MMP-9增加，同時(shí)還可使TIMP-1分泌增加（翻譯后水平）而表達(dá)（mRNA水平）并未增加，具體機(jī)制尚不清楚。

3. 2 他汀藥與MMP/TIMP

PROVE IT（TIMI-22）研究[13]顯示強(qiáng)化他汀治療可使ACS患者30 d的臨件減少，在穩(wěn)定的患者，使臨件長期降低，但其具體機(jī)制尚未完全明確。Luan等[14]報(bào)道，西立伐他汀呈劑量依賴性抑制兔平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但對(duì)TIMP-1和TIMP-2無影響。本研究顯示，與相同濃度AS組相比，5%、10%和20%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性降低（P值< 0.05）；10%、20%SIM組MMP-9蛋白的分泌顯著性減少（P值均< 0.01）。與相同濃度AS組相比，SIM組TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異（P >0.05）；但10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加（P值均< 0.01）。與Luan等[14]的報(bào)道有所不同，本研究顯示辛伐他汀不但在一定劑量范圍內(nèi)可抑制巨噬細(xì)胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌，而且增加TIMP-1的分泌。這可能是辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、減少臨件的機(jī)制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropic effects）[15]，除了調(diào)脂作用外，還有抗炎、改善內(nèi)皮功能等作用。辛伐他汀可能通過抑制巨噬細(xì)胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌，同時(shí)還增加TIMP-1的分泌，從而調(diào)節(jié)MMP與TIMP之間的平衡，起到穩(wěn)定斑塊的作用。

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