時間：2023-05-24 14:35:05
開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇干細胞培養技術，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
2010年諾貝爾生物醫學獎授予英國生理學家羅伯特•愛德華茲，以表彰他在“體外受精”技術領域做出的開創性貢獻。
1978年，羅伯特•愛德華教授和同事一起成功地使第一例試管嬰兒誕生，從此開創了生殖醫學領域的新紀元。試管嬰兒在20多年前也曾被世界輿論界視為洪水猛獸而大加抨擊，但時至今日，這項技術已經被全世界絕大多數國家承認，堪稱醫學史上的一大奇跡。迄今為止，全球已有上百萬試管嬰兒誕生。
被譽為“試管嬰兒之父”的英國劍橋大學教授羅伯特•愛德華說：“克隆單純從技術上講非常簡單，就是把卵細胞中DNA去掉，然后將體細胞中的DNA移入其中。這在世界上任何一個試管嬰兒實驗室中都可以完成，困難在于如何降低克隆的危險。”
本文以此熱點問題作為命題材料，對2011年高考生物試題進行單項預測。預測材料及其涉及的知識、試題如下：
1．試管嬰兒
【知識鏈接】要做好有關“試管嬰兒”的試題，除了書本上的知識外，還要掌握“試管嬰兒”技術的有關知識。“試管嬰兒”技術是通過將不孕夫婦的和卵細胞取出在試管中完全受精，并在試管中培養使其發育到囊胚期，再將胚胎移入女性子宮內使其發育成胎兒。
體外受精步驟包括：的采集與培養、卵母細胞的獲取與培養、體外受精等操作技術。具體過程如下圖:
哺乳動物胚胎發育的過程大體概括如下圖：
例1 下列關于關試管嬰兒的說法，不正確的是（）
A. 從良種母牛體內采集的卵母細胞都需要進行體外培養
B. 從良種公牛采集的需進行獲能處理
C. 早期胚胎移植的意義在于提高優良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵發育至原腸胚時期的胚
解析：本題考查了試管嬰兒的相關知識。根據體外受精和胚胎發育過程圖解可知，早期胚胎指的是由受精卵發育至囊胚時的胚。
答案：D
例2 據2008年1月17日《干細胞》雜志報道，某科學家使用了進行試管受精的年輕女性捐獻的卵子，以及2名志愿者的皮膚成纖維細胞，成功克隆出了5個人體胚胎，進而可以開發出有研究價值的干細胞。請回答：
（1）上述過程中主要應用到的兩項動物細胞工程技術為；若將某經過修飾的基因導入其中的部分胚胎干細胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培養基進行胚胎干細胞培養時，通常需要加入等天然成分；在細胞培養時，要保證被培養的細胞處于一定的氣體環境，所需要的氣體主要有 。
（3）科學家欲進行胚胎分割移植，則應該選擇發育良好、形態正常的或囊胚，將其移入盛有操作液的培養皿中，然后用分割針進行分割。
答案：（1）動物細胞培養、細胞核移植顯微注射技術（法）
（2）血清（血清、血漿） 氧氣和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知識鏈接】克隆人的基本原理是動物細胞核的全能性，包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植。其基本過程為：
細胞核移植技術中注入去核卵母細胞中的不是供體細胞核，而是整個細胞，伴隨著兩細胞融合，體現細胞膜的結構特點：具有一定的流動性。該技術形成重組細胞繼而發育成一個新個體，體現了細胞核的全能性而非動物細胞的全能性。
例3 下圖為克隆人的示意圖，據圖回答：
（1）圖中所涉及的現代生物技術有、和
等。
（2）下列有關胚胎移植的敘述正確的有（）
A.沖卵指的是從子宮中沖出胚胎，而非沖出卵子
B.只有供、受體生理環境高度一致，移入受體的胚胎才能被接受，并繼續發育
C.供體和受體要進行免疫檢查，防止發生免疫排斥反應
D.不同動物其胚胎移植的時間不同，人的胚胎移植最好在四個細胞階段進行
（3）圖中兩個嬰兒長大后，外貌、性格和其他特征與原型男人相同，這說明 具有全能性。
（4）使用培養基進行胚胎干細胞培養時，通常要加入等天然成分，除了保證被培養細胞處于無菌、無毒及充足氧氣的環境中，還需要保證細胞生活所需的；早期胚胎發育在階段以前的細胞是全能細胞。
（5）圖中從“內細胞團到胚胎干細胞”的培養過程中，必須用處理內細胞團，使之分散成單個細胞。干細胞形成組織、器官必須要進行 和 。
（6）在體外培養胚胎干細胞能否獲得動物器官?
。為什么？
解析：（1）該圖利用了細胞核移植、動物細胞培養、胚胎分割移植等技術。（2）沖卵一般是指是胚胎收集中的沖卵――胚胎、早期胚胎。供體和受體只有保證具有相同的生理狀態，才能保證胚胎的正常發育。（3）克隆過程說明動物細胞核具有全能性。（4）動物細胞培養液的成分包括葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。動物細胞培養的條件：無菌、無毒的環境；營養物質（合成培養基）；溫度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；氣體環境（氧氣和二氧化碳）等。（5）動物細胞培養過程常用胰蛋白酶處理組織，以使之分散成單個細胞。（6）胚胎干細胞在體外培養條件下一般只能增殖進行細胞分裂，不能發生細胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 細胞培養（另外寫細胞融合、胚胎分割也對，寫了三個則給滿分）（2）ABD（3）動物體細胞核 （4）血清 溫度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 細胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干細胞在體外培養條件下可以增殖而不發生分化
3．生物技術中的倫理問題
【知識鏈接】生物技術引發的倫理問題包括克隆技術引發的倫理問題、試管嬰兒引發的倫理問題、基因檢測引發的倫理問題。中國政府對于克隆技術的態度是禁止生殖性克隆人，不反對治療性克隆人；對于試管嬰兒的態度，中國衛生部的規定是實施體外受精、胚胎移植及衍生技術必須獲得衛生部的批準證書。
例4下圖所示為人類“治療性克隆”的大致過程。請回答下列問題：
（1）圖中①為 細胞，過程A是目前實現體細胞克隆的關鍵技術，該技術稱為 。
（2）圖中③能誘導分化出神經細胞、血細胞、肌肉細胞，其根本原因是 的結果。這樣培育得到的組織器官進行自體移植的最大好處是 。
（3）若應用轉基因技術治療遺傳性糖尿病，可將健康人的控制胰島素合成的基因導入結構④中的
，原因是這些細胞 。
（4）在用PCR技術擴增胰島素基因時，緩沖溶液中必須加入的物質有：、分別與兩條模板鏈結合的兩種引物、 以及四種脫氧核苷酸。DNA的合成方向總是從子鏈的延伸。
（5）我國政府禁止生殖性克隆，但不反對治療性克隆研究。為什么要反對生殖性克隆（即克隆人）呢？請你寫出一條理由： 。
解析：從圖可以看才出，治療性克隆是將患者的體細胞的核與卵細胞的細胞質進行重組， 形成重組細胞，將重組細胞經過培養得到囊胚，取囊胚內細胞團培養得到不同組織器官，可用于進行自體移植，不會產生免疫排斥反應。
答案：（1）次級卵母（卵） 核移植
（2）基因選擇性表達不會產生排異（免疫排斥）反應
（3）內細胞團分化程度極低（或具有全能性），可使外源基因在相應組織細胞表達
【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。方法 采用全骨髓培養法體外培養細胞，貼壁篩選純化骨髓間充質干細胞并進行體外培養、擴增，應用肝細胞生長因子(HGF)誘導分化出肝干細胞，鑒定后，經肝臟中葉注射入同種異體正常組和暴發性肝衰竭組大鼠體內，于移植后的第1、2、4周取受體肝臟移植原位（注射部位)、鄰位（距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段，研究肝干細胞在大鼠肝臟內定居情況。結果 經肝臟注射移植的肝干細胞在正常組和肝損傷組的肝臟內均能定居，且定居的細胞數量上肝損傷組明顯多于正常組。結論 經肝臟注射移植的骨髓源性肝干細胞可以定居于肝臟內，且定于肝臟的干細胞數量與肝臟是否損傷密切相關。
【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；肝干細胞；細胞移植
骨髓間充質干細胞(MSCs) 具有多向分化潛能，可以在體外誘導分化出肝干細胞，此種骨髓源性肝干細胞可以為肝組織移植工程提供新的細胞來源。近年來的研究主要集中于體外誘導MSCs為肝干細胞，此種細胞具備了肝細胞的形態，在體外能夠表現出一定的肝細胞功能〔1〕，但對骨髓源性肝干細胞在體內的定居和定位能力情況尚不明確。本實驗通過對大鼠MSCs進行體外培養，誘導、分化出肝干細胞，同時建立暴發性大鼠肝衰竭模型，探討骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況。
1 材料與方法
1.1 材料
低糖DMEM培養基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia，比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝細胞生長因子（HGF)(CYTOALAB公司)、細胞培養箱(Forma公司)；純系SD大鼠、3周齡、體重100～120 g(供體大鼠)和成年純系SD雌性大鼠、體重180～220 g(受體大鼠)，由吉林大學實驗動物中心提供。
1.2 骨髓源性肝干細胞培養
1.2.1 MSCs分離、培養及定向肝干細胞的誘導分化
從供體SD大鼠股骨提取骨髓細胞。用比重1.073的Percoll分離液行MSCs分離，加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培養和擴增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)誘導定向肝干細胞分化。
1.2.2 誘導后的骨髓源性肝干細胞鑒定
用ELASA法檢測細胞培養液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫組化法檢測細胞中細胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表達。
1.3 肝損傷動物模型的制作和分組
受體雌性SD大鼠20只，隨機分為正常大鼠組和肝損傷組。肝損傷組用質量濃度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔內注射，劑量1 200 mg/kg體重。
1.4 同種異體大鼠骨髓源性肝干細胞移植
正常組大鼠和肝損傷組大鼠，分別以戊巴比妥麻醉，仰臥位固定，常規消毒、備皮、鋪無菌巾，上腹正中切口，長約1 cm，于肝中葉以BD胰島素注射器注射肝干細胞懸液0.4 ml（107/ml )，觀察無出血后縫合傷口。
1.5 受體體內移植骨髓源性肝干細胞鑒定
應用PCR技術檢測性別決定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干細胞移植后1，2，4 w后取受體肝臟移植原位(注射部位)、鄰位(距注射部位0.5 cm)組織，應用PCR技術檢測〔2〕性別決定因子基因片段(Sry)。引物按文獻〔3〕設計，由上海Casarry生物有限公司合成序列，外引物對SRY1/ SRY2擴增片段大小為317 bp，內引物對SRY3/SRY4擴增片段大小為121 bp。
2 結 果
2.1 骨髓源性肝干細胞的培養結果 大鼠MSCs經原代培養，細胞傳代，誘導分化，細胞異形性較誘導前增加，表現為圓形、橢圓形細胞數量較誘導前明顯增加，而梭形細胞數量減少，誘導培養10 d左右，細胞形態表現為圓形、橢圓形細胞為主，梭形細胞已極少見。免疫組化染色，二氨基聯苯胺（DAB)顯色，在倒置顯微鏡下，可見細胞形狀顯圓形或卵圓形，胞漿內出現棕黃色顆粒。CK18、CK19、Vimentin呈陽性表達。細胞培養液中AFP、ALB含量誘導前分別為(0.021±0.008) ng/ml和(0.72±0.14) g/L；誘導后分別為(0.403±0.042) ng/ml，(6.1±0.32) g/L。誘導后的AFP、ALB含量明顯高于誘導前（P＜0.05)。表明經誘導的MSCs分化為肝干細胞。見圖1。
2.2 肝損傷模型病理結果
D氨基半乳糖注射后，大鼠肝臟肝索紊亂，肝細胞腫脹變性、灶性及大片壞死，伴出血及炎性細胞浸潤。見圖2。
2.3 性別決定因子基因片段檢測結果
肝損傷組：檢測1 w時陰性，2 w時原位肝組織Sry陽性表達，鄰位未表達，而4 w時原位及鄰位組織檢測到Sry表達，原位表達較2 w時增強，鄰位較弱。正常肝臟組：1及2 w均未檢測到表達，4 w時檢測到原位微弱表達。見圖3。
3 討 論
MSCs具有多向分化潛能，特別是具有向肝臟干細胞、肝細胞及血管內皮細胞分化的潛能〔4〕，因而有望成為肝組織移植工程新的種子細胞來源。由于MSCs是成體干細胞，取材方便，可以來自患者自身，無排斥反應，故具有重要的臨床應用價值。本實驗根據文獻報道〔5〕，使用HGF，使MSCs分化為肝干細胞，對骨髓源性肝干細胞同種異體移植后在受體大鼠模型肝內定居情況進行初步研究。
目前研究表明移植肝干細胞可存活于受體許多部位包括肝、脾、腹腔、胰腺、肺、腸系膜、腎及腎脂肪囊、腹膜后等部位〔2，6～8〕。肝臟由于其獨特的營養環境、生理及解剖結構環境無疑是最理想的場所，可經門靜脈輸入或肝實質植入，該組實驗采用肝臟植入方法，取得較好效果，說明此方法是安全可行的。本實驗采用同種異體移植，應該考慮免疫排斥反應，但文獻報道，純化的MSCs具有獨特的免疫原性，進行同種異體移植不需要預先應用免疫抑制劑，無免疫排斥反應，是良好的基因治療靶細胞。
目前鑒定受體體內被移植后的肝干細胞有許多方法，其中較為常用的是以雄性動物為肝干細胞供體〔1〕，雌性動物接受細胞移植后，分化增殖的細胞 Y 染色體陽性，證明雌性受體內存活的細胞來自雄性供體細胞，這就可以清楚地將植入的細胞與原有的細胞區分開來，進一步研究移植作用，本實驗采用雄性供體細胞為雌性受體移植，檢測移植部位細胞的Y染色體表達情況，進而檢測移植細胞是否定植。
實驗結果顯示，移植后2 w肝衰竭大鼠移植原位檢測到表達，4 w表達明顯增強，而且臨近部位出現表達；正常大鼠在移植后4 w移植原位出現微弱表達。實驗證實，骨髓源性肝干細胞在正常大鼠肝臟及肝損傷大鼠肝臟內均能定居，但在肝損傷大鼠肝臟內定居能力明顯增強。考慮可能為大鼠肝損傷后，刺激機體分泌出各種促進肝細胞再生的生長因子，為移植細胞提供定居所需的微環境。文獻報道，在正常大鼠體內，HGF等因子的活性是被抑制的，只有在肝損傷時，啟動肝再生程序，這些因子才能被激活，引起肝細胞有絲分裂。
本文通過實驗證實了大鼠骨髓源性肝干細胞移植后可以定居于受體肝臟內，而且在肝損傷后有利于干細胞移植的定居，這為下一步研究定居于肝內的骨髓源性肝干細胞的功能奠定了基礎。
參考文獻
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[關鍵詞]表皮干細胞；酶消化法；組織工程皮膚；分離；培養
[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2011）01-0079-04
Improved culture method of Human epidermal stem cell and tissue engineering skin construction
ZHANG Yan-gang, HU Da-hai, ZHANG Zhan-feng,CAI Wei-xia, ZHU Hua-yu, SHE Tao
(Department of Burn and Skin Surgery, Burns Center of PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 701132,Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo improve the traditional methods of dissociation and culture of the human epidermal stem cells (hESCs) and provide more productive and more active seed cells for tissue engineering skin construction.MethodsCell morphology was observed by inverted microscope, MTT law growth curve. Immunocytochemistry was used to observe the expression of β1 integrin and keratin 19 (CK19) on epidermal stem cells. Compare the morphological features of tissue engineered skin constructed with the seed cells which were obtained by two methods.Results Trypan blue staining displays the number of hESCs dissociated by modified method is(92.25±15.61)significantly elevated compared with traditional method (68.50±26.91)(P＜0.01),and the proportion of living cells 94%±0.01% increased significantly compared with traditional method(75%±0.04%)(P＜0.05).The result of immunocytochemistry showed that the expression of β1 integrin and keratin 19(CK19) was positive, which were markers of hESCs. HE staining showed that, by using the improved method, the number of multiple epidermal layers was 5～6 on tissue engineering, and cells of epidermal in the basal partwere arranged. In contrast, the number of multiple epidermal layers was 3～4, and the cells of epidermal in basal part arranged in scattered by using the traditional method. ConclusionHuman epidermal stem cells in a larger amount and better vitality can be obtained by using a modified enzyme digestion method, which form basis of construction of skin tissue engineering.
Key words:human epidermal stem cells; enzyme digestion; tissue engineering skin; dissociating; culturing
近年來仿照皮膚的生理結構，人們構建各種組織工程皮膚，有望解決皮源短缺及預后瘢痕的問題，其種子細胞主要是表皮干細胞、成纖維細胞等。因此，表皮干細胞的分離、培養就成了必須面對的問題，在以往的報道中[1-4]，有關hESCs的培養常采用中性蛋白酶（Dispase）消化過夜分離表皮層、再以0.25%胰蛋白酶37℃消化10～15 min分離表皮干細胞，但實際應用中發現該方法存在細胞活力差，產率低等缺點。本研究中我們采用改良后的方法分離培養hESCs并和常規的培養方法加以比較，旨在建立一種更為高效的分離培養表皮干細胞的方法。
1材料和方法
1.1 實驗材料和主要儀器：取小兒包皮組織（2～6歲），(來自西京醫院泌尿外科包皮環切術，均取得患者家屬知情同意)。DispaseⅡ酶（Gibco）；Trypsin（Gibco）；DMEM (Hyclone)；胎牛血清（FBS，杭州四季青）；角質形成細胞無血清培養基(K-SFM，Gibco)；表皮生長因子（epidemal growth factor, EGF）和牛垂體提取物（bovine pituitary extract, BPE）(Gibco)；人胎盤Ⅳ型膠原(Sigma)，MTT (Gibco)；DMSO (西安化學試劑廠)；多聚甲醛(西安化學試劑廠)；小鼠抗人β1整合素（鼠單抗IgG）、CK19（鼠單抗IgG） (北京中杉金橋生物技術公司）；鼠尾膠原（自制）；臺盼藍；倒置熒光顯微鏡（Olympus）；M680型酶標儀（伯樂公司）。
1.2人表皮干細胞分離、培養：修剪皮下結締組織，0.9% NaCl浸泡、清洗3遍，每次5～10min，0.05%醋酸氯已定+0.9% NaCl（1:2，體積比）浸泡5～8min，再次0.9% NaCl浸泡清洗3遍，每次10min，然后將上述組織塊置于4℃ Dispase酶(0.25%)浸泡14～16h。以下為兩種方法分離人表皮干細胞。
傳統方法：取出皮片，0.9% NaCl反復清洗，分離表皮和真皮層，剪碎表皮為1.0mm×1.0mm，加0.25% Trypsin + 0.02% EDTA，37 ℃水浴10min加入含有10% FBS的DEME終止消化。反復吹吸至細胞懸浮，200目篩網過濾，1 000rpm離心5～10min，棄上清，收集細胞，用人表皮干細胞培養基重新懸浮細胞（10ml），吹打成單細胞懸液，臺盼藍染色。并接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的25cm2培養瓶內，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育10～15 min后，吸出培養液及未貼壁細胞，PBS洗2次，加入適量新鮮培養基（K-SFM，5ng/ml hEGF，30 μg/ml BPE）繼續培養。
改良方法：取出皮片，0.9%氯化鈉反復清洗，分離表皮和真皮層，將表皮置于小抗生素瓶后加0.125% Trypsin+ 0.01% EDTA3ml，彎頭吸管快速攪拌2min，吸出并加入離心管（已經加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，再次重復消化一次，吸出后加入另一離心管（已經加有10% FBS的DMEM 1.5ml）中和，將前后兩次消化液體合并，離心（1 000rpm，5min），PBS10ml懸浮細胞，臺盼藍染色鑒定后，再次離心（1000rpm，5min），表皮干細胞培養基（K-SFM）懸浮細胞，接種于預先鋪有Ⅳ型膠原的培養瓶內，置于37℃，5% CO2孵育箱中孵育4～5min后，吸出培養液及未貼壁細胞，PBS洗2次,加入適量新鮮表皮細胞培養基培養（K-SFM，5ng/ml hEGF, 30μg/ml BPE）。
1.3表皮干細胞增殖：將兩種方法分離出的hESCs分別作MTT比色試驗。兩組細胞均以1×105個/孔的密度接種預先鋪有Ⅳ型膠原的24孔板內，每24h取3孔做MTT比色實驗。根據每天記錄的細胞數繪制細胞生長曲線圖。
1.4 表皮干細胞鑒定：取二代表皮干細胞培養36 h，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗；0.1%Triton X-100孵育10min；PBS清洗3次，每次5min；3%H2O2去離子水孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶活性；2%山羊血清封閉20 min,加入CK19（1:50稀釋）、整合素-β1（1:50稀釋）一抗4 ℃過夜；PBS洗5次，滴加生物素化二抗工作液200μl，37℃孵育10min，PBS洗5次；滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液200μl, 37℃孵育10min，PBS洗5次；顯色劑顯色。
1.5構建組織工程皮膚：以兩種不同方法分離、培養的hESCs為種子細胞，鼠尾膠原復合成纖維細胞作為支架材料構建組織工程皮膚。4ml 5×DMEM和14ml膠原于冰上混勻，用1mol/L NaOH調至中性后，加入2mlFBS（含2×106成纖維細胞）混勻，以3ml/孔加入Transwell小室內，放入37℃，5% CO2孵箱培育，待其凝固后加入10% FBS的DMEM，繼續培養，24h后將2代hESCs以3×106/孔種植于鼠尾膠原表面，氣-液面培養1周。
1.6 統計學分析：采用SPSS11.0軟件進行統計處理，實驗數據以x±s表示，兩組間均數比較行兩樣本t的方差分析， P＜0.05為差異有顯著性意義。
2結果
2.1 改良消化法和傳統消化法細胞消化效率的比較：將同一塊包皮組織等份分開，用兩種方法同時分離表皮細胞，臺盼藍染色、細胞計數（總體積均為10ml），實驗獨立重復5次。
2.2改良法和傳統法分離細胞形態學比較：采用Ⅳ型膠原粘附法分選表皮干細胞，改良法較傳統法粘附細胞密度大，4h后大部分細胞貼壁良好，鏡下可見細胞胞體小，核質比大，呈三角形或多邊形。接種后第二天培養基中存在一定數量的漂浮細胞，但改良法漂浮細胞數明顯少（圖2）。3天后，有部分細胞形成較小克隆，胞體緊密相靠，胞膜互相銜接，呈典型“鋪路石樣”生長。
2.3改良法和傳統法細胞增殖比較：兩組細胞在第2天細胞數量有所下降，均在第4天時進入對數生長期，改良法細胞在對數期呈明顯上升趨勢，于第7天到達平臺期，鏡下觀察細胞融合；傳統法細胞對數期上升緩慢，第8天時細胞仍未融合。由此表明出改良法細胞活性較好生長較快（圖3）。
2.4改良法和傳統法分離細胞的鑒定天對采用兩種方法培養的hESCs行K19、β1整合素免疫染色，結果顯示，95%以上細胞K19、β1整合素均呈陽性表達(圖4)，且兩種方獲得的表皮干細胞生物學特性無顯著差異。
2.5 改良法和傳統法分離的細胞構建組織工程皮膚組織學比較：兩種方法分離培養的hESCs分別構建出的組織工程皮膚均呈3層：由下到上為真皮層、表皮層、角質層。改良法細胞構建的組織工程皮膚表皮層厚，約5～6層，表皮和真皮交接處可見細胞排列整齊，形似基底細胞。傳統法細胞構建的組織工程皮膚表皮層較薄，約3～4層，表皮真皮交接處未見類似基底細胞（圖5）。
3 討論
hESCs是皮膚組織的特異性干細胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能。是皮膚發生、修復、重塑的關鍵性源泉[5]，以其作為種子細胞構建組織工程皮膚，可獲得與生理皮膚相類似的組織結構。臨床上大面積較深度燒傷往往導致表皮、真皮的損傷缺失，近年來，利用含有hESCs的組織工程皮膚覆蓋創面取得一定的效果，而在其構建的過程中表皮干細胞的分離培養是必須面對的問題。
傳統的方法中表皮層與真皮層分離后，用剪刀剪碎成1.0mm×1.0mm大小后進行胰蛋白酶消化，減碎的過程中暴露在組織邊緣的細胞增多，而剪刀的擠壓可對組織造成擠壓損傷[6]，導致部分細胞壁損害進而細胞活力下降或死亡，在改良的方法中，直接進行胰酶消化避免了這一損傷情況的發生。在胰酶消化這一步，傳統方法采用0.25%胰蛋白酶＋0.02% EDTA，37℃水浴，10min，而改良方法以0.125%＋0.01% EDTA胰蛋白酶也可以消化下來表皮干細胞，并且胰蛋白酶的含量低，減少了胰蛋白酶對細胞的損傷。當胰酶將細胞分泌的粘蛋白膜水解后，如還沒有終止它的活性，此時胰酶就有可能進攻細胞內的某些蛋白質，造成它們的解離，進而誘發細胞凋亡[7]。胰酶濃度的降低也少了中和血清的用量，從而降低了血清對hESCs分化的影響[8]。對比傳統方法，將37℃消化改為常溫下消化，進一步降低胰酶的活性。為了進一步減少胰酶對細胞的損傷，再將傳統方法的消化10min改良為2次消化，每次2min總計4min，每次消化后立即終止。以往的方法中，用來消化時，將剪碎的細胞置于胰酶中反復吹打，而吹打本身也會造成細胞損傷，且吹打容易產生泡沫加劇細胞損害，本改良方法中，只以吸管做攪動，充分均勻胰酶的消化作用又不會產生吹吸的作用，減少了細胞在反復吹打過程中的損傷。
將同一塊包皮組織等份分開，用兩種方法同時分離hESCs，臺盼藍染色結果表明：改良法的活細胞率明顯大于傳統法細胞，從形態上觀察，細胞展開生長無差異。我們用兩種方法培養的原代細胞繪制細胞生長曲線（圖3），可以看出改良法細胞存活數量多，增殖速度快，細胞活性好，證明了改良法培養可以快速獲得大量hESCs。研究表明，K19表達陽性的細胞多分布在毛囊隆突部和基底膜，且具有干細胞的慢周期性和強大的增殖特性，而終末分化的表皮細胞則表達K10。所以K19也被認為是表皮干細胞的特異性標志[9]。β1整合素不僅介導表皮干細胞與細胞外基質的黏附，也調控終末分化啟動，β1整合素表達的降低會刺激表皮干細胞離開干細胞池，向上遷移成為終末分化細胞，因而認為β1整合素高表達可以是表皮干細胞的標志物之一[10-11]。我們將應用Ⅳ膠原快速貼壁的改良法細胞通過細胞免疫化學方法研究，顯示改良法細胞K19、β1整合素呈陽性表達，證實了采用改良方法培養的細胞為hESCs。進一步分別采用兩組細胞為種子細胞，鼠尾膠原為支架構建組織工程皮膚，組織切片HE染色顯示改良組hESCs細胞構建的組織工程皮膚表皮層較厚，細胞復層多，表皮細胞復層層數為5～6層、基底細胞排列整齊，而傳統組hESCs構建的組織工程皮膚表皮細胞復層層數為3-4層、基底細胞排列散亂，表明應用改良組細胞更適宜構建組織工程皮膚（圖5）。
表皮干細胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細胞群，在正常狀態下維持表皮的自我更新，當受到損傷刺激時，表皮干細胞可以參與皮膚損傷的修復[12]，本研究采用改良法分離培hESCs并與傳統方法對比，顯示出改良方法培養出的hESCs活力和增值能力更好，構建的組織工程皮膚具有更好的形態結構，為以表皮干細胞為種子細胞構建組織工程皮膚進一步奠定了基礎。
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【摘要】 ［目的］探索在旋轉生物反應器內，應用微載體技術快速擴增并向軟骨分化人脂肪干細胞。［方法］將人脂肪干細胞結合Cytodex3微載體在旋轉的生物反應器（RCSS）內進行動態培養，應用倒置顯微鏡和掃描電鏡對微載體表面的脂肪干細胞進行動態觀察，并對收獲的脂肪干細胞進行SafraninO、toluidine blue染色等組織化學染色及Ⅱ型膠原的免疫化學染色分析。［結果］脂肪干細胞于24 h內貼附于Cytodex3微載體表面，細胞形態為短梭形，隨時間的延長，貼附于微載體的細胞逐漸增多，到培養后期，細胞密度可達最初接種的19倍左右，在微載體上收獲的細胞進行番紅花O、阿利新藍染色呈陽性，Ⅱ型膠原染色陽性，均強于對照組。［結論］利用微載體細胞培養技術可簡便快速地在體外擴增脂肪干細胞，并成功實現向軟骨細胞分化。
【關鍵詞】 脂肪干細胞； 生物反應器； 微載體； 軟骨細胞
自從2001年Zuk等人［1］從脂肪中提取出了具有多向分化潛能的干細胞后，脂肪干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)以其來源廣泛，取材方便，擴增迅速等優點迅速成為了組織工程的研究熱點。多項研究證實，ADSCs在體外可以向多種細胞系分化，包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經及內皮［2、3］。其生物學特性與骨髓基質干細胞非常相似，在組織工程領域頗具應用前景。而軟骨是公認的最適于應用組織工程技術構建的組織，因此以ADSCs作為軟骨組織工程的種子細胞，具有很高的實用價值。構建組織工程軟骨通常要求短期內獲得大量的種子細胞，并且在體外培養過程中能夠保持良好的表型。傳統的靜態培養方式很難滿足這些要求，而立體三維動態培養不但可以加速細胞的增殖，而且利于軟骨方向分化及表型的維持［4］。因此，本研究利用生物反應器技術結合微載體對ADSCs進行快速擴增同時向軟骨細胞方向誘導，旨在觀察ADSCs在微載體上增殖分化情況，探討其未來臨床應用的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
Ⅰ型膠原酶，地塞米松，2磷酸1抗壞血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣馬)，FGF2、TGFβ1(Peprotech，UK)，Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體(北京中山公司)，旋轉生物反應器(Synthecon)，Olympus倒置顯微鏡(Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的分離培養 取膝關節置換術中切除的髕下脂肪墊，嚴格保持無菌，取材后30 min內進行干細胞分離。在超凈工作臺中，用顯微剪刀仔細剔除脂肪組織表面的筋膜和小血管，DHank's沖洗3遍以洗去紅細胞的污染。剪碎，加入5倍體積的0.075%的Ⅰ型膠原酶，37℃、攪拌30 min，離心2 000 r/min，5 min，傾去上層脂肪及上清，DHank's洗滌，100目篩網過濾。離心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank's洗2遍，將細胞重懸于含10%FBS的高糖DMEM培養基，48 h后換液。細胞長滿80%后，用0.25%胰酶消化傳代培養。至第2代時，換培養液為軟骨誘導液(5 ng/ml FGF2，10 ng/ml TGFβ1，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone，1xITS)進行軟骨方向誘導分化。
1.2.2 Cytodex 3預處理 取干重微載體珠50 mg，放入10 ml的潔凈玻璃瓶中。向瓶中加入不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，室溫下至少孵育3 h以膨脹微載體珠，用巴氏吸管棄去上清液，PBS清洗微載體2次，棄去PBS，再加入新鮮不含鈣和鎂離子的PBS 10 ml，高壓滅菌20 min，吸除上清液，微載體用培養液清洗，置于4℃冰箱中備用。
1.2.3 細胞培養方式 將Cytodex 3微載體50 mg及ADSCs(最終濃度1×105/ml)加入到10 ml體積的RCSS培養容器中，并補加軟骨誘導培養基至充滿容器。把接種細胞的容器連接于旋轉底座。整個裝置放于5%CO2孵箱，于37℃常規條件下培養。開始以5 r/min的速度旋轉5 min，以充分混合細胞，然后停止旋轉5 min。再旋轉容器5 min，再停止容器旋轉5 min。多次重復循環，最后持續旋轉容器并逐步調整轉速至10～12 r/min。視培養基顏色及pH值決定是否換液及換液量。ADSCs靜止培養是以1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，接種5孔，培養過程中每2～3 d更換培養液，保持細胞供養充足。
1.2.4 細胞形態學觀察和計數 人ADSCs分別培養1、3、5、7 d，取樣本于倒置顯微鏡下觀察微載體表面ADSCs生長形態及增值變化情況，消化、分離微載體表面的軟骨細胞并用血細胞計數板計數，描記細胞培養生長曲線。并取第3 d細胞微載體樣本，進行掃描電鏡觀察，觀察細胞生長形態及基質分泌情況。對照組靜態單層培養的ADSCs細胞，分別于1、3、5、7 d觀察細胞生長形態及增值變化情況，并收集一孔細胞計數，描記細胞生長曲線。
1.2.5細胞化學及免疫細胞化學分析分別將微載體上生長的ADSCs和單層培養的ADSCs進行消化收集，爬片，應用SafraninO染色，toluidine blue染色觀察細胞外基質中GAG合成和分泌情況。應用Ⅱ型膠原單克隆抗體與細胞爬片共同孵育，以DAB為底物應用免疫過氧化物酶法顯色，陽性染色為棕色反應，觀察Ⅱ型膠原分泌合成情況。
2 結果
2.1 ADSCs在Cytodex 3微載體表面貼附生長情況
細胞接種3 h后，細胞開始貼附于微載體表面，24 h后，絕大部分細胞已經貼附在微載體表面，培養基中僅可見少量死亡細胞。細胞由球形、半球形逐漸伸展為短梭形，偶見偽足伸出，形態不規則(圖1a)。第3 d，微載體表面細胞明顯增多，在不同焦距平面上均可見細胞貼附生長，細胞周圍可見基質分泌沉淀，微載體間偶見細胞連接。細胞形態呈短梭形扁平狀。培養基中少見死亡細胞，電鏡掃描，細胞在微載體表面貼附良好(圖1b)。第5 d，微載體大部分空間已被細胞所覆蓋，細胞層疊生長，大量基質分泌，單個細胞形態不易區分，微載體之間可見寬大的細胞連接體，微載體呈團狀生長(圖1c)。第7 d，微載體已被完全覆蓋，表面細胞互相重疊呈團塊狀，這使得微載體表面變得粗糙、凹凸不平。微載體間廣泛存在細胞連接，培養基中幾乎無脫落細胞(圖1d)。
2.2 ADSCs在靜態培養中生長情況
細胞接種于誘導培養基2 h后，開始貼壁，24 h后全部貼壁。細胞形態為短梭形或多角形，與未誘導ADSCs相比較細胞個體略大。完全貼壁后即開始快速增殖，3 d達到50%融合，5 d達到80%融合。隨細胞密度增加，增值速度減慢，7 d基本完全融合。
2.3 2種不同培養方式下ADCSs的生長曲線
在第1、3、5、7d，分別從RCCS容器及普通培養瓶中收集ADSCs并計數，做生長曲線如圖2。臺盼藍染色排除試驗顯示，從微載體上回收ADSCs存活率90%以上。血細胞計數板計數，可見ADSCs于RCSS接種后的第3 d起生長加速，至第7 d細胞密度達到最高值，約為最初接種的19倍。靜態單層培養第7 d收獲細胞總數約為最初的6倍余。
2.4 細胞化學及免疫細胞化學檢查分析
2組不同培養方式的ADSCs爬片染色顯示，微載體培養的細胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈強陽性，強于靜態培養組，表明細胞外基質中含有大量GAG；Ⅱ型膠原染色亦呈強陽性。結果表明微載體上培養的ADSCs經過動態誘導培養，有軟骨特征性基質成分表達(圖3～5)。
3 討論
脂肪來源干細胞容易獲得，并且來源廣泛，與骨髓基質干細胞一樣均屬于來自中胚層的成體干細胞。De Ugarte等［5］發現來源于骨髓和脂肪組織的干細胞在細胞獲得率、細胞老化、基因轉染和細胞的黏附特性等方面沒有明顯的差別。因此，ADSCs作為軟骨組織工程的種子細胞，具有不可多得的優勢和前景。
作為臨床應用，構建組織工程軟骨往往需要大量的種子細胞，有研究表明當細胞數量少于1×107/ml時就不能形成軟骨或生成很少［6］。傳統的培養方式不僅擴增速度慢，而且不容易維持干細胞誘導后的表現；在三維培養條件下則有利于ADSCs向軟骨方向分化，并促進細胞外基質的合成［7］；而動態三維立體培養則進一步提高了組織工程軟骨的生物化學功能和生物力學功能。
微載體細胞培養技術是一種微載體與生物反應器結合的技術，現已廣泛應用于組織工程領域。在動態培養過程中，外部流體力學刺激能夠明顯增加細胞增殖，促進細胞DNA的合成，利用生物反應器和微載體進行細胞擴增，細胞濃度最高可達到1×108/ml［8，9］。這在常規培養條件下是很難達到的。這首先是由于微載體有較大的表面積(Cytodex 3 110 g提供約4600 cm2的表面積)［2，5］，相同容積的生物反應器和普通培養瓶相比，前者可比后者多培養數10倍甚至100倍的細胞，可以滿足較大體積組織構建對種子細胞數量的需求；其次因為整個培養容器由電機驅動沿水平軸旋轉，培養基以及細胞顆粒隨容器一起旋轉，細胞微載體顆粒在水平軸內建立均質的液體懸浮軌道，使細胞所受到的重力、浮力及剪切力達到平衡，這就構成了一種微重力培養環境，利于細胞聚集，并在微載體表面各個方向上均衡擴增生長；最后一點在這種動態環境中，細胞與營養物質易于均質分布，顯著改善微環境中的營養物質及代謝產物的交換，保持培養環境的均一性和穩定性，有效促進了細胞的增殖。
組織構建的另一個難題是怎樣保持其誘導表型，不發生去分化。生物反應器和微載體介導的動態三維培養，不但為細胞增殖提供了良好的環境，而且周期性的力學刺激作為一種必要的物理信號在細胞的分化過程中起到了重要的作用。在動態環境中細胞活性增強，加之誘導因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特異的細胞外基質，促進了細胞的分化和成熟。總之，這種動態培養微環境提供了細胞聚集、快速三維生長和分化的條件，為工程化組織構建提供了更為有效的手段［10］。本實驗的結果也證實了這一點，實驗中ADSCs在微載體上能夠迅速貼附、伸展并快速增殖。第7 d細胞已將微載體表面完全覆蓋，并凸出微載體表面生長，微載體間相互連接，呈團狀生長。微載體培養在1周的時間內細胞數量增長了近20倍，而靜態培養則僅為6倍，組織化學及免疫組織化學均顯示微載體培養的細胞有較好的表型及細胞外基質。本研究為以ADCSs作為種子細胞構建組織工程軟骨提供了實驗依據，為進行更加深入的研究奠定了基礎。
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【關鍵詞】 人端粒酶逆轉錄酶 端粒酶 人骨髓間充質干細胞 基因
Abstract：［Objective］To explicate whether the telomerase activity is regulated by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human bone marrow mesenchyme stem cells(hBMSC).［Method］hBMSC were cultured and transfected with eukaryotic expressing plasmid pCIneohTERT encoding hTERT. After selection with G418 to stabilize the transfection，expression of hTERT mRNA was detected with TRPCR， detecting the expression of hTERT protein was detected with Western Bolt， and the telomerase activity in untransfected and transfected cells were detected by RTPCR.［Result］The hMSCs grew well after transfecting plasmid pCIneohTERT.The cells began to suspend and die after the day of the G418 selection. At the tenth day，all the untransfected cells were dead， but the transfected cells began to clone proliferation. So the density of G418 subdued to 100 μg/ml for maintaining selecting， at the twentieth day，there were obvious antiG418 cell clones. After stable transfection， hTERT was expressed at mRNA and protein level in these anti418 cell clones， and meanwhile telomerase activity was positive and obviously raise up in these transfected cells.［Conclusion］In human' bone marrow mesenchyme cells，telomerase could be activated by exogenous hTERT. This is a foundation to establish immortalized human bone marrow mesenchyme stem cell line.
Key words：hTERT; telomerase; human bone marrow mesenchyme stem cell; gene
髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchyme stem cell，hBMSC)目前作為組織工程的種子細胞，在基礎研究與臨床中得到廣泛應用。但是也存在許多問題［1～3］，在基礎研究中存在如何得到純化，甚至標準的細胞系，使各實驗室之間以及實驗室前后研究之間具有可比性和延續性的問題；在臨床生物工程應用中存在細胞老化、去分化，以及生物工程化器官過程中，如何獲得足夠數量的種子細胞的問題［3］。
細胞培養廣泛應用于基礎研究、臨床實踐和生物工程［4］。然而，正常組織來源的細胞在通常的體外培養條件下經過有限次的傳代后，就會停止分裂增殖，發生衰老和死亡［5］，這就限制了細胞培養技術的進一步應用。因此，學者們提出建立永生化細胞系，使體外培養的細胞具有無限增殖能力。
研究表明，端粒酶的激活可以延緩細胞的衰老，甚至使細胞永生化［6，7］。TERT作為端粒酶的逆轉錄酶，與細胞端粒酶的活性高低密切相關［8］。本實驗將外源性人TERT(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉染至克隆培養的hBMSC中，以明確hTERT能否調控其端粒酶活性，為建立永生化人骨髓間充質干細胞系奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 主要試劑與材料
LDMEM低糖培養基，胰酶，限制性內切酶EcoRI、SalI，Midi質粒純化試劑盒，G418：均為美國Gibco BRL公司產品；胎牛血清為美國Hyclone公司產品；LipofectAMINE 2000轉染試劑盒：美國Invitrogen公司；端粒酶活性檢測試劑盒：華美生物工程公司；質粒pCIneohTERT(hTERT基因克隆至真核表達載體pCIneo，酶切位點EcoRI和SalI)美國學者Weinberg RA惠贈。
1.2 方法
1.2.1 質粒DNA的轉化、擴增、純化和鑒定 挑取生長良好的大腸桿菌DH5α單菌落制備為感受態細胞，取50 μl感受態細胞，加2 μl質粒pCIneohTERT溶液進行細菌轉化，過夜后挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養液進行質粒的擴增，按試劑盒說明書提取并純化質粒。核酸蛋白分析儀進行濃度和純度的測定后，取10 μl質粒以EcoRI和SalI雙酶切(各0.5 μl)，1％瓊脂糖電泳進行鑒定，其余置-20°保存待用。
1.2.2 細菌培養和基因轉染 原代單克隆培養的人骨髓間充質干細胞［9］接種于24孔板，每孔約2×105個細胞，待細胞長到90％時，按LipofectAMINE 2000轉染試劑盒說明書進行pCIneohTERT的轉染。24 h后1∶10傳代，次日加G418，濃度為200 μg／ml。經過9～10 d，未轉染組細胞在G418作用下全部死亡，此時將G418濃度降為100 μg／ml，繼續培養，20 d左右出現明顯細胞抗性克隆。在顯微鏡下用含胰酶的10 μl移液槍轉移至24孔板擴大培養。取轉染前及轉染后第10、25代細胞進行以下實驗。
1.2.3 hTERT mRNA的表達 用Trizol裂解沉淀細胞后，提取總mRNA。根據hTERT的mRNA序列(Gene Bank)和參考文獻［10，11］， 設計PCR擴增的兩條引物：上游5'-GACACACATTCCACAGGTCG-3’和下游5'-GACTCGACACCGTGTCACCTAC-3'，預期產物片段為175 bp。采用Titan TM One Tube RT-PCR Kit進行RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達。RT-PCR參數為：50° 30 min；94° 10 s，60° 30 s，68° 45 s，10個循環；94° 10 s，60° 30 s，68° 2 min，25個循環；68°，7 min。
1.2.4 hTERT蛋白的表達 參照文獻［12，13］，以三去污劑裂解液裂解細胞，提取細胞內總蛋白，經核酸蛋白分析儀定量后，每孔上樣量為50 μg，進行hTERT的Western Blot分析。采用Western Blotting Luminol Reagent測試劑盒顯色。同時，取細胞爬片，多聚甲醛固定后，按說明書進行細胞免疫組織化學染色，免疫熒光顯色。
1.2.5 端粒酶活性的檢測 按端粒酶活性檢測試劑盒說明書操作。收集2×106個細胞，洗滌離心后裂解，冰浴30 min，離心后上清即含細胞端粒酶。取2 μl進行RTPCR擴增端粒酶重復序列。擴增產物經雜交反應后顯色，測定波長450 nm處的吸光度A值，反映細胞端粒酶活性。其中陽性對照：人胚腎轉化細胞系293細胞；陰性對照：65°處理293細胞30 min。陰性對照A值低于0.05時按0.05計算，高于0.05時按實際值計算，樣本大于陰性對照A值的3倍時，判為端粒酶活性陽性。
2 結 果
2.1 質粒擴增和酶切鑒定
質粒pCIneohTERT經試劑盒提取純化后，核酸蛋白分析儀分析表明：A260／A280和A260／A230的比值分別為1.80和2.12，說明提純質粒好，基本無蛋白、RNA及酚的污染，可用于基因轉染；濃度為0.55 μg／ μl。采用EcoRI和SalI雙酶切后電泳如圖1所示，酶切片段與預期大小一致，表明質粒無誤。
圖1 pCIneohTERT酶切鑒定(M:2kb Marker，D：酶切，P:質粒)
2.2 細胞培養和基因轉染
細胞轉染質粒pCIneohTERT后，生長狀態良好。加G418后第2 d，細胞開始懸浮，逐漸死亡。第10 d，未轉染組細胞在G418作用下全部死亡，轉染組細胞開始克隆增殖。G418濃度降至100 μg／ml維持篩選，20 d左右開始出現明顯抗G418細胞克隆(圖2)，用移液槍轉移，擴大培養。
圖2 轉染后BMSCs的G418抗性克隆形成17 d觀察
2.3 hTERT mRNA的表達
轉染后第10、25代細胞的總RNA經RTPCR后可獲得約175 bp的特異性片段，表明細胞在mRNA水平上表達hTERT(圖3)。
2.4 hTERT蛋白的表達
Western Blot檢測結果顯示轉染細胞在124 ku左右見特異性條帶，為hTERT蛋白，轉染前細胞未能檢測到該蛋白(圖4)。
細胞免疫組織化學染色顯示hTERT蛋白定位于細胞核(圖5)。
圖3 RTPCR分析hTERT mRNA表達，獲175bp特異片段(P10，P25轉染傳代細胞；C：對照原代細胞) 圖4 Western Blot分析hTERT蛋白的表達(P10，P25轉染傳代細胞，C：對照原代細胞) 圖5 hTERT蛋白的表達，免疫細胞化學染色，免疫熒光×200
2.5 端粒酶活性
端粒酶檢測結果，圖6表明原代BMSC仍然存在一定端粒酶活性，但是活性較低。轉染后BMSCs端粒酶活性轉為陽性，并且持續保持陽性表達，其活性可達到人胚腎細胞系的水平。
圖6 端粒酶活性比較
3 討 論
端粒是真核細胞染色體末端富含G的DNA重復序列，由DNA及其相關蛋白組成，雖不含基因，但是在穩定染色體方面具有重要作用［14，15］。端粒酶是一種能延長端粒末端的核酸蛋白酶，由蛋白質和RNA組成，可以以其自身的內源性RNA為模板，發揮RNA指導的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列，使端粒延長，從而延長細胞的壽命。正常情況下，除了一些生殖細胞和胚胎干細胞表達端粒酶活性以外，其他體細胞都不表達端粒酶活性［6］。現在已經明確人端粒酶由3個部分組成［17］:(1)端粒酶自身的RNA模板：端粒酶以自身RNA為模板，以端粒的3'-overhang為引物，在端粒的末端加上新的重復序列，使端粒延長。在多種人體正常組織中均有人端粒酶RNA的表達；（2)人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)：是端粒酶的活性部位。Meyerson等［18］克隆出人的編碼端粒酶催化亞基的cDNA，hTERT mRNA在大多數缺乏端粒酶活性的正常體細胞中不能檢測到；（3)端粒酶的相關蛋白：TP1／TLP1基因編碼端粒酶的相關蛋白，和端粒酶的活性沒有必然的聯系，具體功能尚不清楚。上述3個組成部分中hTERT是恢復端粒酶活性的關鍵。然而，有學者發現hTERTmRNA在組織分布上與端粒酶活性并不完全一致［19］，而且端粒酶的組成和結構至今尚未完全明確。另外，端粒酶活性受到復雜機制的調節，在不同層次上存在各種調節因素，如端粒長度變化、端粒酶RNA和蛋白組分、癌基因和抑癌基因、細胞分化和細胞周期等。所以，目前還不能斷定hTERT與端粒酶激活的必然聯系，即并不是每一種細胞轉染hTERT基因均可激活該細胞的端粒酶活性。
為了明確在人骨髓間充質干細胞中導入外源性hTERT能否調控端粒酶活性，作者克隆培養hBMSC［9］，導入克隆至真核表達載體pCIneo的hTERT基因。G418篩選20d后形成抗性細胞克隆，移液槍轉移，擴大培養，細胞端粒酶活性轉為陽性。因此，作者認為在hBMSC中，導入外源性hTERT可以激活端粒酶，其活性可達到人胚腎細胞系的水平。
目前，有關端粒和端粒酶的研究主要集中在腫瘤的基因治療上［20］，抑制端粒酶活性，促進腫瘤細胞凋亡。借用這一思路，反之，構建hTERT真核表達質粒轉染體外培養的細胞，使細胞在體外培養的生命期延長，用于構建組織工程化標準種子細胞系，可能是解決體外培養細胞增殖困難、傳代時間短、細胞衰老的方法之一，且hTERT真核表達質粒較病毒載體的安全性更高。以往研究結果表明［10，11］，將編碼hTERT的基因轉染到正常人成纖維細胞和血管內皮細胞，可以使正常人體細胞突破“Hayfliek極限”，細胞壽命得以延長，細胞可在體外長期傳代，無致瘤性，細胞仍保持正常的形態和功能。
實驗表明，用脂質體法將構建的hTERT真核表達質粒pCIneohTERT體外轉染人骨髓間充質干細胞，轉染后的細胞端粒酶活性明顯提高，為進一步建立人骨髓間充質干細胞標準細胞系奠定了基礎。
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【關鍵詞】 骨髓間充質干細胞；生物學特性；細胞培養
The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells
〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro， and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods
MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29， CD44， CD105 and negative for CD34.
Conclusion
In present culture condion， MSCs showed stable and rapid
growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.
〔Key Words〕
Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture
干細胞是具有自我更新能力，且在適宜微環境下具有多系分化潛能的原始細胞[1]。近年研究發現，機體內除胚胎干細胞外還存在具有自我更新和分化能力的成體干細胞。其中骨髓中的干/粒細胞包括間充質干細胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），造血干細胞及網狀內皮系統。 MSCs 可在體外擴增并有多向分化潛能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩定及易于轉染外源基因等，因而作為組織工程“種子細胞”有“廣泛的應用前景”[5-8]。本實驗通過對兔 MSCs 體外培養法及其生物學特性進行研究，以建立一套穩定、成熟的兔 MSCs 培養方法，從而為細胞移植等組織工程提供種子細胞來源提供實驗基礎。
1
材料及方法
1.1
主要試劑與儀器
低糖 DMEM 培養基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細胞分離液（上海華精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標記的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細胞培養箱（Forma）、流式細胞儀（FACSCalibur， BECTON DICKINSON 公司，美國）及超凈工作臺（ESCO）等。
1.2
實驗動物
普通級健康新西蘭大耳白兔，雌性，兔齡約 3 個月（南京市第一醫院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK [蘇] 2002-2007）。
1.3
方法
1.3.1
骨髓 MSCs 的分離純化與培養
兔仰臥固定于兔臺上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 號骨穿針，沿脛骨平臺垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）潤洗過的 10 mL 無菌注射器，抽取骨髓 4 mL，緩慢疊于等量 Ficoll 淋巴細胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度離心 20 min，分離骨髓單個核細胞，收集界面上的細胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復 2 次，棄上清，懸浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2 培養瓶，置 37℃，5% CO2 及飽和濕度培養箱中培養。4~6 d 首次換液，以后每 3 d 或 4 d 換液 1 次，14~21 d 細胞生長融合達 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例傳代培養，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態。
1.3.2
骨髓 MSC 貼壁率檢測
取對數生長期細胞，0.125% 胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，調整細胞濃度為 1×105/mL，接種于 24 孔培養板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培養板，吸去 4 孔培養液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未貼壁細胞，0.125% 胰蛋白酶消化后離心收集細胞，進行細胞計數，共觀察 12 h，按以下公式逐個計算每個時相點的貼壁率：貼壁率=（貼壁細胞總數/接種細胞總數）×100%。
1.3.3
骨髓 MSCs 生長曲線的測定
取第 3 代生長良好的細胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制備細胞懸液，以每孔 103~104 個細胞于不同時相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 L，置于 37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 繼續孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細胞生長曲線。
1.3.4
骨髓 MSCs 表面標記測定
取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心 5 min，PBS 洗滌 2 次，調節細胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對照），室溫反應 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加 FITC 標記的抗兔 IgG，避光反應 15 min 后，經流式細胞儀檢測細胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 陽性細胞的表達。
2
結
果
2.1
MSCs 的形態學變化
原代培養中，可見細胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天細胞大部分呈圓形、橢圓形生長；第 3~7 天貼壁細胞增多，并逐漸延展生長為多角形、星形或梭形； 7~21 d 貼壁細胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達 80% 以上，細胞排列呈漩渦狀，細胞間界限不清，細胞呈長梭形；14~21 d 后，細胞傳代，傳代后的細胞不以集落方式生長，而是均勻分布長梭形細胞。
2.2
MSCs 各時相點細胞帖壁率
見表 1。
2.3
MSCs 生長曲線分析
實驗發現，細胞傳代培養 1~2 d，吸光度變化不大，甚至有輕微下降，細胞處于潛伏期，第 3 天起呈對數生長，至第 7 天到達高峰，之后進入平臺期，見圖 2。
根據計算細胞的倍增時間公式可得：
DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h
2.4
MSCs 表面標記
流式細胞儀結果顯示：CD34、CD45 陽性細胞均為 0.8%；CD29 和 Cd105 陽性細胞數為 99.8%。說明分享獲得的細胞符合骨髓間充質干細胞的特點（見圖 3）。
3
討
論
MSCs 體外培養的生長特點和生物學特性已有較多相關文獻報道。MSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細胞的 0.001%~0.01%[9]，如何獲得高純度、足量的 MSCs，成為 MSCs 應用研究的關鍵。
目前常用于 MSCs 分離方法有密度梯度離心法[10-11]、貼壁篩選法[12]、免疫磁珠法[13]、流式細胞儀分離法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培養板篩選法。采用全骨髓貼壁篩選法，將抽取的骨髓直接置于培養瓶中培養，利用骨髓間充質干細胞貼壁生長的特性分離細胞，幾天后換液觀察細胞貼壁情況，這種保留造血干細胞和各種細胞混合培養的方法，由于維持了 MSCs 原始的生活環境，有利于 MSCs 分化，但所得細胞成分復雜， MSCs 純度不足。單克隆抗體磁珠分離系統或流式細胞儀技術對細胞活性影響較大，甚至導致細胞完全失去活性，而且實驗操作復雜，需要骨髓量大，不易重復，造價較高，一般僅限于在大實驗室應用[16]。特制微孔培養板篩選法，可以快速有效分離得到相對同質的 MSCs，利用這種方法可以不用 Percoll 液去除紅細胞[17]，但是結果不穩定，特定原料不易大量獲取。密度梯度離心法即根據骨髓中細胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴細胞分離液提取單核細胞進行貼壁培養。操作上較貼壁細胞分離法煩瑣，得到的細胞數不如后者多，但細胞純度較后者高。本實驗結合密度梯度離心法和貼壁篩選法，利用密度為 1.077 g/L 的 Ficoll 分離液，能有效去除絕大部分紅細胞、粒細胞、脂肪細胞和血小板，獲得純度較高的單個核細胞。然后利用 MSCs 的貼壁性，逐漸棄掉未貼壁細胞，從而獲得足量的 MSCs。
在培養過程中，我們還注意到以下幾個環節：①與蔣雯等[18]不同，本實驗研究發現，兔 MSCs 原代培養首次換液的時間宜在 4~6 d，過早換液將丟失過多尚未貼壁細胞，因在實驗過程中，第 3 天首次換液后，收集舊培養液離心洗滌，再接種仍有細胞大量生長；且原代細胞在培養 14 d~21 d 左右才能達到80% 以上的融合，才能進行傳代培養，這可能與我們用的培養基加的胎牛血清濃度不同，蔣雯等用的是 20% 的血清，而我們用的是 10% 的胎牛血清；②培養基中胎牛血清濃度保持在 10% 左右為宜，過低由于缺乏生長因子的刺激，細胞增殖減慢，而過高又因含大量促進細胞生長增殖分化的因子，易引起細胞過早出現老化；③兔 MSCs 原代接種貼壁不良時，可予膠原[19]包被培養瓶，增加細胞的貼壁率；④胰蛋白酶消化細胞時，可先將 PBS 潤洗培養瓶 2 次，去除殘留血清，更易將貼壁細胞消化下來，且消化時間縮短，不會造成消化時間過長對細胞的損傷；⑤細胞傳代時，應注意接種密度，宜按 1:2 比例傳代接種，如此細胞才能保持良好的增長趨勢，不會因接種密度過稀致增長緩慢且易老化。
目前 MSCs 在生物醫學領域有著廣泛的應用，然而 MSCs 表面標志由于細胞分離、培養方法和培養時間等的不同而有差異。Pittenger 等[20]認為人MSCs 陽性表面標志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血細胞標志。Hung 等[21]采用帶 3 m 孔培養板的裝置培養分離得到人 MSC，培養至第 2 代末時陽性表面標志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應用不同的分離擴增方法及不同的方式表達細胞特性，使得對一些研究結果的比較變得困難，阻礙了其在這些領域的應用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了 MSCs 的最低標準： 首先，MSCs 在標準培養條件下必須具備貼壁生長的特點；其次，MSCs 表達 CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達陰性；第三，MSC 在體外能分化為格根包爾氏細胞、脂肪細胞和成軟骨細胞[23]。本實驗選擇第 3 代細胞行流式細胞儀檢測表面抗原顯示，陽性表達黏附分子、整合素家族成員等如細胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 陽性細胞數占 99.8%，而造血細胞表面標志陰性或極少表達即 CD34 陽性率只有 0.8%，上述結果表明：獲得的細胞為非造血類的、符合骨髓間充質干細胞的特點，與文獻資料吻合[12，24]。
通過對兔MSCs 培養方法和表面標識物的進一步研究，本研究建立了一套穩定分離、培養擴增骨髓間充質干細胞的方法，獲得足量純化的 MSCs 并進而研究其作為種子細胞治療多種疾病提供了實驗基礎。隨著基因工程和組織工程的發展，骨髓 MSCs 也將在細胞治療、基因治療等方面得到廣泛應用。本研究設計的缺陷在于，這只是細胞培養的一個初步研究，下一步若對細胞周期及細胞活力進行檢測，將對選擇最合適代數細胞作為種子細胞的應用提供更有價值的信息。
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[關鍵詞]成體干細胞；基因治療；隨意型皮瓣
[中圖分類號]Q789 [文獻標識碼]A [文章編號]1008―6455(2007)01-0007-04
皮瓣是用于修復較大的組織缺損和外露臟器的帶血供的皮膚軟組織，但是在轉移手術后皮瓣經常發生血運障礙。研究表明，血管內皮細胞生長因子(VEGF)可以促進血管的新生，從而提高缺血皮瓣的成活面積。成體干細胞載體可以治療多種疾病。研究表明，MSC等成體干細胞可以作為中樞神經性疾病等多種疾病的基因治療載體，例如MSC可以作為VEGF、FGF等多種細胞因子基因治療的載體，并通過旁分泌作用釋放VEGF促進側支循環的建立和血管的再生，而MSC自身則不參與缺血組織的治療。目前ADSCs作為基因治療載體的報道較少見，本研究旨在闡明脂肪干細胞可以作為運送VEGF基因到達皮瓣的細胞載體并通過旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面積。
1 材料和方法
1．1材料：3周齡SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美國Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165質粒(本室構建并保存)、DMEME(Dul―beccos modified eagle balancedsalt solution)培養基、0．1％Ⅰ型膠原酶(美國Worthington公司)、CD49天抗體(北京中山生物技術公司)、恒溫CO2培養箱、臺式離心機(LingLi公司)、Calibur型四色流式細胞儀(美國Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。
1．2方法
1．2．1 rADSCs的分離和原代培養：SD大鼠麻醉后，在無菌下切取腹股溝脂肪墊，剪碎后加入0．1％Ⅰ型膠原酶消化40～60min，加入2倍體積的D-Hank’s液，離心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養基稀釋，轉種到培養瓶中。
1．2．2 rADSCs的鑒定：收集處于對數生長期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分別加入鼠抗鼠的CD49天單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗掉未結合的抗體，加入異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠二抗，室溫下放置30min，PBS洗掉未結合的抗體。用流式細胞儀檢測。同時用PBS／FBS／NANO3代替一抗作為空白對照。
1．2．3脂質體介導VEGF轉染rADSCs：生長到70％～80％融合的細胞，用新鮮無血清DMEM培養基洗滌2遍。按LipofectamineTM2000操作說明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－VEGF165質粒分別8．0μg和LipofectamineTM2000 20μl混合，室溫靜置20min后，加入1ml不含血清的DMEM培養基，37℃、轉染rADSCs 8h后，換成含血清的DMEM培養基繼續培養24h，換成最小致死劑量0．5g/L的G418選擇培養基，抗性細胞篩選，2周后細胞克隆形成，其陽性克隆在0．5g/L的G418維持劑量壓力下繼續擴大培養2周備用。
1．2．4 ELISA檢測被轉染rADSCs上清中VEGF濃度：各組rADSCs在培養24h后收集培養上清，用ELISA試劑盒檢測培養上清中VEGF濃度，以平均pmol／1×106細胞／48h(x±s，n＝4)表示。
1．2．5被轉染rADSCs的標記：在傳代后的細胞培養液中加入新鮮配制的Brdu，終濃度5μg/m1，至細胞生長到95％以上融合后備用。接種在12孔板中的rADSCs在用Brdu標記后經抗Brdu單抗進行免疫細胞化學染色，隨機觀察5個視野并計數。
1．2．6動物實驗：消化收集標記Brdu的rADSCs并臺盼藍染色記數為1×1077／ml，用D-Hank’s液反復3次洗滌，制成2ml的rADSCs的單細胞懸液用于注射動物模型。在大鼠背部一側制備直徑8×2．5cm的背部隨意型皮瓣模型，掀起皮后保留皮下的肉膜。實驗組有10只大鼠，在每只大鼠腹腔內注射2ml被轉染的rADSCs單細胞懸液，對照組有8只大鼠，在每只大鼠腹腔內注射2ml被空載體pcDNA3．1(一)轉染的rADSCs單細胞懸液。分別于術后7天用透明紙描記法記錄皮瓣成活范圍，用數坐標紙格子數的方法計算成活面積并換算為成活百分率。術后3天在皮遠端切取全層皮膚組織標本并用4％的多聚甲醛固定1h，然后用80％到100％的系列梯度的乙醇脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色和抗Brdu免疫組化染色。
1．2．7統計分析：數據用x±s表示，t檢驗。
2 結果
2．1 rADSCs的分離和培養以及鑒定：原代培養的rADSCs在貼壁后細胞形態均一，呈梭形的單層成纖維細胞樣。流式細胞學檢查示第3代rADSCs均一性較好，CD49天陽性率為95．3％。
2．2細胞轉染與篩選效果：經轉染和G418篩選后，非轉染組的和pcDNA3．1(一)空載體轉染組的細胞100％死亡，而pcDNA3．1－VEGFl65重組質粒轉染組的細胞在篩選約2周后有數量較多的細胞集落，提示克隆化基因的細胞轉染及G418篩選效果良好。
2．3 ELISA檢測轉染后細胞上清中VEGF濃度
2．4動物實驗中大白鼠在手術后生命體征平穩，精神好，進食和飲水均好。術后7天，各組皮瓣的成活面積如下(表3、圖1)，術后3天皮瓣遠端皮膚組織抗Brdu免疫組化染色(圖2)。
3 討論
脂肪組織的基質成分中含有具有自我更新和多能分化潛能的脂肪干細胞(adipose derived stemcells，ADSCs)，我們以往的研究結果表明脂肪組織可以促進皮膚創面的愈合。由于脂肪組織來源廣泛，取材方便，可以獲得的基質細胞數量大，所以可以作為替換MSC來源的成體干細胞。ADSCs和MSC之間CD標記的區別是ADSCs表達CD49天，本實驗通過流式細胞學對培養的rADSCs表面抗原CD49天陽性的檢測確證和鑒定了培養的細胞是ADSCs。
pcDNA3．1－VEGFl65重組質粒轉染組的細胞經G418篩選后出現數量較多的細胞集落，而非轉染組的細胞100％死亡，提示VEGF基因轉染細胞的效果和G418篩選細胞的效果都良好。ELISA檢測轉染后細胞上清中VEGFl65濃度隨時間而升高，而非轉染組和pcDNA3．1(一)空載體轉染組的細胞上清中VEGFl65濃度較低，提示VEGF165在rADSCs中有效表達，并被正確修飾，rADSCs可以作為基因治療中的載體細胞。因此，理論上可以將獲得的穩定表達VEGF165的rADSCs移植到體內實施基因治療。
Brdu是常用的一種標記細胞核的熒光染料。注入到腹腔的被轉染rADSCs的Brdu標記細胞陽性效率可達70％以上，臺酚藍染色記數注入到腹腔rADSCs為1×107，較高的Brdu標記率和充足的細胞數量是rADSCs在本移植實驗研究中作為皮瓣基因治療載體細胞的前提。
隨意型皮瓣是常用于研究皮瓣成活能力的模型。本實驗選用大鼠背部的8cm×2．5cm隨意型皮瓣模型，皮瓣遠端由于超出長：寬＝1：1．5的比值范圍，因而是血流供應較少的部位，在手術后局部出現血流緩慢，內皮細胞缺氧脫落和血栓形成等一系列的病理生理學改變，最終導致遠端超出血流供應范圍皮的缺血壞死。本研究結果表明，實驗組皮瓣的成活面積(59．6±0．52)％，大于對照組的皮成活面積(40．5±0．27)％，P
[關鍵詞] 起搏樣細胞；CD45；HCN4；NF-160；竇房結
[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0009-04
Inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro
WEN Yu1 LI Bin2
1.Department of Histology & Embryology， Basic Medical College of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110122， China； 2.Department of Sports Medicine， Affiliated Shengjing Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 110022， China
[Abstract] Objective To study method on inducing directional differentiation of mouse bone marrow CD45-cells into sinoatrial node pacemaker-like cells in vitro. Methods Mouse bone marrow CD45-cells were derived by using immunomagnetic beads system. After amplification in vitro， induced medium supplemented with 5-azacytidine and culture supernatant liquid of mouse sinoatrial node cells was used to cultivate. The expression on pacemaker-like cells markers of neurofilament protein （NF-160） and hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel （HCN） 4 were detected by immunofluorescence staining. The expression of pacing genes （NF-160， HCN4 and HCN2） were detected by qRT-PCR. Results Differentiated cells of bone marrow CD45-cells after induced by culture in vitro expressed NF-160 and HCN4. qRT-PCR analysis showed， compared with cultured sinoatrial node cells in vitro， the expression of NF-160 and HCN4 were higher， while expression of HCN2 was lower. Conclusion The sinoatrial node pacemaker-like cells can be induced and differentiated from mouse bone marrow CD45-cells， and the cells will be one choice of ideal seeding cells for biological pacemaker building.
[Key words] Pacemaker-like cells； CD45； HCN4； NF-160； Sinoatrial node
心律失常是常見病，嚴重將危及患者生命。目前，對于嚴重心律失常、病態竇房結綜合征患者，安裝心臟起搏器是理想的治療方法[1-3]。隨著生物學及干細胞研究的發展，利用其相關技術逐步構建生物起搏器，對受損心傳導系統的組織進行修復或替代，尤其是竇房結功能重建，可以使心臟的起搏和傳導功能得以修復[4-5]。構建生物起搏器的種子細胞目前以干細胞為主[6-7]。由于骨髓源干細胞具有多向分化潛能，可自體獲得，并能夠在體外擴增，是比較理想的種子細胞，所以本研究采用5-氮胞苷聯合竇房結細胞培養上清液體外誘導培養骨髓CD45-細胞，探討其分化為起搏樣細胞的可能性。研究周期為2014年8月～2015年1月，旨在為臨床因竇房結起搏細胞數量減少或功能衰退造成的心傳導系統功能障礙、嚴重心律失常等疾病的替代治療以及生物起搏技術的應用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、儀器和試劑
1.1.1 實驗動物 選取昆明小鼠10只，雌雄不限，4～5周齡，體重20～30 g，常規飼養，健康。
1.1.2 主要儀器和試劑 低糖DMEM和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Hyclone；DMEM-F12購自Gibco；5-氮胞苷（5-azacytidine）購自Sigma；兔源HCN4一抗、小鼠來源NF-160一抗和TRITC標記山羊抗兔IgG購自Abcam；FITC標記山羊抗小鼠IgG和DAPI購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA extraction kit購自Qiagen；PCR引物購自生工生物工程（上海）有限公司；SYBR Green Real Time-PCR Master Mix購自Invitrogen。免疫磁珠分選系統（Miltenyi Biotec），激光共聚焦顯微鏡（Nikon EZ-C1），PCR儀（Roche Light Cycler？R480）。
1.2 小鼠骨髓CD45-細胞純化、擴增
隨機取5只小鼠經2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺無菌條件下取出小鼠股骨和脛骨數根，用低糖DMEM反復沖洗髓腔，收集沖洗液，經400目尼龍篩網過濾，1000 r/min離心6 min，棄上清。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養基重新混懸細胞，37℃，5%CO2，飽和濕度培養，1 d后換液，棄去未貼壁細胞，以后每2天換液1次。細胞長至80%融合時，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS的低糖DMEM培養基重新混懸，以1∶3傳代。培養大約1個月后，采用免疫磁珠分選系統，選取CD45抗體，按照說明書操作，使細胞通過分選柱，收集CD45-細胞。采用添加了10%FBS的低糖DMEM培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養。
1.3 小鼠竇房結組織分離、培養，收集培養基上清液
余下5只小鼠經2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，70%乙醇浸泡30 min，超凈臺無菌條件下取出心臟，解剖顯微鏡下將心臟界嵴中部靜脈竇側、前腔靜脈根部0.3 cm × 0.3 cm × 0.3 cm大小組織塊，剪成1 mm左右大小的碎塊，添加0.07%胰蛋白酶消化，經篩網過濾后，1000 r/min離心5 min，加入添加了20%FBS的DMEM-F12培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養4 h，吸出未貼壁細胞重置于6孔板中，繼續培養。每天半量換液。
1.4 條件培養基誘導分化骨髓CD45-細胞
收集竇房結細胞培養后的培養液，經1000 r/min離心10 min，取上清與10%FBS的低糖DMEM培養基1∶1混合，并添加10 mmol/L的5-氮胞苷，作為CD45-細胞的條件培養基。CD45-細胞經條件培養基培養后2～3周，選取生長穩定細胞，進行檢測。
1.5 免疫熒光檢測分化細胞起搏標志物表達
將生長良好的分化細胞接種至8孔Chamber中，培養過夜，常規免疫熒光染色，一抗兔HCN4（1∶200）、小鼠NF-160（1∶300），二抗TRITC標記山羊抗兔IgG（1∶500），FITC標記山羊抗小鼠（1∶500）。激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。
1.6 qRT-PCR檢測誘導分化細胞起搏基因表達
選擇生長良好的分化起搏樣細胞和小鼠竇房結細胞作為對照，采用RNA extraction kit提取兩種細胞的總RNA，稀釋濃度為200 ng/μL，然后逆轉錄合成cDNA，再采用SYBR Green Real Time-PCR Master Mix方法檢測小鼠NF-160、HCN4和HCN2基因表達，選取GAPDH作為內參，引物序列見表1。NF-160、HCN4和HCN2基因表達結果以倍數變化表示。設立對照以確定無DNA污染。反應體系為20 μL，其中cDNA模板1 μL，Nuclease-free water 8.2 μL，NF-160、HCN4、HCN2基因引物序列上游引物和下游引物各0.4 μL，2X SYBR Green Master Mix 10 μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，進行35個循環（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s），然后72℃再延伸10 min，4℃保存。實驗重復3次。
表1 SBYR Green法qRT-PCR引物
2 結果
2.1 小鼠骨髓CD45-細胞及誘導培養基誘導分化細胞
CD45-細胞貼壁后多為短梭形、三角形、多邊形，排列無規律，細胞體積較小，分散生長（圖1A）。生長良好的CD45-細胞更換為條件培養基后，細胞形態發生明顯變化，體積變大，大小比較一致，多呈長梭形，向同一方向生長（圖1B）。
2.2 分化細胞起搏標志物表達
經免疫熒光染色后，發現絕大多數分化細胞NF-160和起搏離子通道HCN4表達陽性，可見胞質內呈絲狀表達的NF-160和HCN4，胞核未著色（圖2，見封三）。
2.3 誘導分化起搏樣細胞起搏基因qRT-PCR檢測
與培養的竇房結細胞比較，分化起搏樣細胞NF-160、HCN4、HCN2基因表達水平不同，以倍數形式表示，其中NF-160、HCN4表達水平較培養的竇房結細胞高（P < 0.01），而HCN2表達水平低于培養的竇房結細胞（P < 0.01）。見表2和圖3。
表2 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達水平
注：與小鼠竇房結細胞比較，*P < 0.01
與小鼠竇房結細胞比較，*P < 0.01；誤差線表示實驗結果為3次實驗平均值
圖3 起搏基因NF-160、HCN4和HCN2表達水平
3 討論
20世紀末，Makino等[8]首次以5-氮胞苷誘導培養骨髓間充質干細胞，發現能夠體外分化為心肌樣細胞，部分細胞的動作電位與心臟起搏細胞相似。隨后，大量研究圍繞起搏樣細胞的誘導分化展開。目前，常用方法有應用5-氮胞苷誘導分化方法[8-9]、起搏離子通道基因轉移方法[10-11]和竇房結細胞裂解液誘導分化方法[12]。但是這些體外誘導分化條件仍不完善，單獨應用成功率低，所以本實驗聯合應用5-氮胞苷和竇房結細胞培養上清液，提高誘導效率。
5-氮胞苷誘導分化機制是可引起細胞DNA中某些胞嘧啶的去甲基化，激活表達肌細胞的特異性啟動或分化調控基因，從而使啟動細胞向心肌分化，并表達心肌細胞特異性標志物，并有一部分細胞具有自律性[8，13]。由于竇房結是一個多態性的結構，心臟成纖維細胞能通過縫隙連接提高心肌細胞間的交通，因而穩定培養心肌的自發性收縮節律。因此，體外培養時不必將竇房結細胞完全分離純化。竇房結細胞培養液對CD45-細胞的誘導分化作用依賴于竇房結細胞分泌的細胞因子，可以為干細胞向起搏樣細胞分化提供一個接近于竇房結細胞生長的環境。
研究表明，竇房結起搏細胞的電生理特性為舒張期自動除極化，起主要作用的是起搏電流，其分子基礎是HCN，包括HCN1～HCN4，小鼠心臟主要表達HCN4和HCN2，以竇房結細胞HCN表達水平最高，所以選擇HCN4和HCN2作為檢測指標[14-17]。
本實驗采用全骨髓細胞直接接種，然后經免疫磁珠分選其中的CD45-細胞，換用條件培養基誘導分化的方法，從成年小鼠骨髓源干細胞得到竇房結起搏樣細胞。該方法操作簡便，得到細胞量大，細胞成活率高，傳代后，細胞形態漸趨同一，排列趨同一個方向，光鏡下可見胞體呈梭形，胞質淡染，胞核明顯，位于胞體中央。筆者采用小鼠竇房結細胞培養基上清液，并添加5-氮胞苷作為條件培養基，得到的起搏樣細胞能夠表達起搏離子通道HCN4和神經絲蛋白NF-160，由qRT-PCR結果看出，分化細胞表達起搏離子通道，符合起搏細胞特點，說明得到的細胞大部分是起搏樣細胞。形態學和免疫組織化學染色研究顯示，得到的細胞具有較好的生物學活性，證明誘導分化方法有效，得到起搏樣細胞在體外能夠存活較長時間，并保持其生物學活性，為生物起搏器奠定實驗基礎。
目前仍有尚未解決的問題，比如得到的細胞并非全部是起搏樣細胞，還包含有其他細胞成分，這些混雜的細胞會對進一步研究帶來干擾，因此進一步完善誘導分化條件或增加分化后的篩選指標，利用流式細胞分離技術或免疫磁珠分選，對得到的細胞進行分離提純，以提高細胞純度。
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【關鍵詞】 嗅鞘細胞； 神經干細胞； 急性脊髓損傷； 神經營養素-3
【Abstract】 Objective：To observe the impact of olfactory ensheathing cells combined neural stem cells in rats with acute spinal cord injury and neurotrophin-3 Expression.Method：80 SD rats were selected， after acute spinal cord injury modeling by Allen's method， the rats were randomly divided into the control group （sham group）， the experimental 1 group （NSCs transplantation group）， the experimental 2 group （OECs transplantation group） and the experimental 3 group （NSCs+OECs transplantation group）. Cells were used local injection method to transplant. In the preoperative and postoperative 1， 3， 5， 7， 14， 21， 28 days， adopt BBB score， improved Tralov score and inclined plane experiments were used to rate the status of rat’s hindlimb motor function， tested motor evoked potential（MEP N1 wave） preclinical. Finally， one rat in each group were selected， randomly， then perfused， drawn and fixed. Immunohistochemical staining were used to observe neurotrophin-3（NT-3） in the damaged spinal cord tissue localized expression in each group. Result：（1）After modeling and cell transplanting， the rats’ BBB rating and improved Tralov score was 0 points within 24 hours， inclined plane experiments’ angle decreased very significantly， from the previous experiment（82.00±3.45） ° reduced to（12.73±1.34） °（P
【Key words】 Olfactory ensheathing cells； Neural stem cells； Acute spinal cord injury； Neurotrophic-3
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.22.008
脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）是中樞神經系統的一種嚴重創傷，近年來其發病呈逐年增多的趨勢[1]。如何有效地治療脊髓損傷已成為當今研究的熱點難題[2]。在治療脊髓損傷眾多方法中，細胞移植的治療方法越來越受到人們的重視。本實驗采用局部注射法將神經干細胞（NSCs）及嗅鞘細胞（OECs）分別、共同移植于大鼠脊髓受損區，通過行為學評價（BBB評分、改良Tarlov評分和斜板實驗）、電生理檢測（運動誘發電位）及免疫組織化學的方法觀測各種指標，從而考察兩種細胞移植后在脊髓損傷區的存活、分化、表達及功能情況，以期為脊髓損傷的臨床治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物 SD雄性大鼠購買自內蒙古醫科大學實驗動物中心，共83只，其中3只（出生3 d內）用于神經干細胞及嗅鞘細胞的培養取材。余80只大鼠用于實驗。
1.2 主要試劑與儀器 試劑：DMEM/F12細胞培養液、B27、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）、兔抗鼠巢蛋白（Nestin）單抗、兔抗鼠P75單抗、兔抗鼠NT-3單抗、異硫氰酸熒光素（FITC）標記羊抗兔二抗、NT-3染色SP試劑盒等；儀器：5% CO2培養箱、倒置熒光顯微鏡、垂直流潔凈工作臺、電熱恒溫水浴鍋、玻璃細胞培養瓶等。
1.3 實驗方法
1.3.1 細胞培養及鑒定 （1）神經干細胞（NSCs）的培養及鑒定：新生（出生3 d內）SD大鼠消毒后，引頸法處死。無菌條件下，充分暴露出嗅球、兩側大腦半球及小腦。外科顯微鑷剪斷與海馬有聯系的大腦皮質或神經組織，仔細剝離海馬。垂直流潔凈工作臺內，無菌條件下將海馬表面的軟腦膜剔除干凈，4 ℃生理鹽水內清洗3次后，將海馬放入DMEM/F12細胞培養液中，顯微鏡下用顯微外科剪將其剪碎，巴氏吸管先反復輕柔機械吹打分離，不銹鋼細胞濾網過濾后離心沉淀，最后將沉淀加入含bFGF、EGF和B27的DMEM/F12細胞培養液內，細胞培養瓶中懸浮培養，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。3～4 d換液1次，每次換50%培養液。傳代一次約需5～7 d。第二代細胞用特異性Nestin抗原免疫熒光染色法鑒定NSCs。最后將細胞濃度調整為1×109/L，備用。（2）嗅鞘細胞（OECs）的培養及鑒定：同樣方法，無菌條件下取大鼠兩側嗅球后培養OECs。3 d全部換液1次。傳代1次約需16 d。第二代細胞用P75受體單抗免疫熒光染色法鑒定OECs。最后將細胞濃度調整為1×109個/L，備用。
1.3.2 實驗動物分組 SD雄性大鼠（體重200～300 g）80只，按隨機數字表法分為對照組（假手術組）15只、實驗1組（NSCs移植組）20只、實驗2組（OECs移植組）20只和實驗3組（OECs+NSCs聯合移植組）20只，剩余5只大鼠備用。分組完成后將大鼠做好標記。
1.3.3 大鼠急性脊髓損傷Allen’s模型的制備及術后一般情況和處理 （1）模型制備：腹腔注射麻醉大鼠起效后，手術區備皮，將大鼠俯臥固定于手術臺上，消毒、鋪巾，背部正中切口，鈍性剝離椎旁肌，縫線牽拉開，顯露T10～12棘突、橫突及椎板。切除T10棘突及椎板下部、T12棘突及椎板上部和全部T11棘突及椎板，形成方形骨窗，充分暴露相應脊髓節段（T11）的硬脊膜及椎管，作為打擊損傷區域。自制的改良Allen’s撞擊器15 g自6 cm高度自由落下，對T11段脊髓造成損傷，制成急性脊髓損傷動物實驗模型[3]。打擊完成后，4 ℃生理鹽水沖洗2次，依次逐層常規縫合切口。（2）術后一般情況和處理：術后大鼠禁食水數小時，以后逐漸增加進食水量至正常。7 d內先單獨飼養，7 d后5只合籠飼養。術后7 d內青霉素2×105 U肌注2次，預防傷口、肺部感染，每日飼喂呋喃坦啶水以預防泌尿系感染。大鼠術后出現尿潴留，在其恢復之前，每日應給予按摩膀胱協助排尿3次。
1.3.4 局部注射法行細胞移植 進行細胞移植之前，先將部分NSCs與OECs混合，用于實驗3組的聯合細胞移植。各組細胞移植均在急性脊髓損傷動物實驗模型制作完成24 h以內進行。操作方法：造模成功以后，4 ℃生理鹽水沖洗后，外科顯微鑷輕柔提起T11處硬脊膜，1 mL無菌注射器針頭在硬脊膜上刺一小洞，垂直進針，緩慢向該處硬脊膜下約3 mm、脊髓損傷方向插入，緩慢注入細胞懸液0.1 mL（細胞數約為1×105個）。關閉切口前，小塊可吸收明膠海綿微加壓填塞于硬脊膜進針點處，防止細胞移植液及大鼠腦脊液的滲漏。對照組生理鹽水代替細胞移植液，作陰性對照，余操作步驟與實驗組相同。
1.4 功能檢測
1.4.1 行為學評價 術前和術后1、3、5、7、14、21 d和28 d，隨機抽取實驗組15只大鼠及全部對照組大鼠，采用BBB評分法、改良的Tralov評分法和斜板實驗，對大鼠后肢運動功能狀況進行雙盲法評分，與手術之前相比較，以了解受損脊髓功能恢復情況。
1.4.2 神經電生理檢測 運動誘發電位（MEP N1波）的檢測，觀察外周運動神經（坐骨神經）的功能狀態。檢測方法：大鼠麻醉起效后，環形切開頭后部皮膚，剝離至骨膜，細紋螺釘鉆孔，孔的大小以剛好將刺激電極放入為宜。根據MEP的產生原理，刺激電極置于皮層，記錄電極置于后肢大腿后側坐骨神經處，參考電極置于硬腭下。刺激類型是：單脈沖粗電壓，強度3 V，波寬1 ms、頻率10 Hz，濾波3000 Hz，增益20倍，時間常數0.01 s，次數100次。檢測完畢后縫合切口。
1.5 大鼠灌注、取材、固定與免疫組織化學染色 各組隨機抽取1只大鼠進行灌注、取材與固定，免疫組織化學染色的方法測定NT-3標記陽性細胞指數，檢測NT-3在局部受損脊髓組織中的表達情況。操作方法：腹腔麻醉起效后，開胸后經左心室主動脈插管，剪開右心耳，先快速灌注冰鹽水，清亮液體流出后，再用多聚甲醛經心灌注、固定動物，速度先快后慢。切取T10～T12脊髓節段上下各約1 mm脊髓節段，立即放入中爾馬林溶液內后固定，再入蔗糖溶液內脫水，置4 ℃下至沉底，常規石蠟包埋，切片機連續切片，厚度為10 um。免疫組織化學染色按NT-3染色SP試劑盒操作說明進行（操作步驟詳見說明書）。NT-3染色陽性的標志是細胞漿或細胞膜呈棕黃色。選取15張最優切片，每張切片在10倍光鏡下分別計數4個視野內染色陽性細胞，測定各組染色陽性細胞在總計數細胞中所占比例（即陽性細胞指數），重復5次，求平均值。
1.6 統計學處理 采用SPSS 11.5統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，不同時間點比較采用單因素方差分析（ANOVA），以P
2 結果
2.1 SD大鼠急性脊髓損傷細胞移植后BBB評分變化 對照組及各實驗組大鼠術后24 h內BBB評分均為0分，隨著實驗的進行，各組均表現出不同程度的恢復情況。其中實驗組恢復速度及程度大于對照組（P
2.2 SD大鼠急性脊髓損傷細胞移植后改良的Tralov評分變化 所有大鼠模型制備完成后及術后任一檢測時間點，Tralov評分均顯著低于術前。隨著實驗的進行，各組大鼠均表現出不同程度的恢復情況。與BBB評分的統計分析結果相似，實驗組Tralov評分均顯著高于同一檢測時間點的對照組（P
2.3 SD大鼠急性脊髓損傷細胞移植后斜板實驗角度變化 造模及細胞移植術后，大鼠斜板實驗角度大幅下降，術后1 d由（82.00±3.45）°降為（12.73±1.34）°，差異有統計學意義（P0.05）；1周后，實驗組與對照組比較差異均有統計學意義（P
2.4 SD大鼠急性脊髓損傷細胞移植后MEP（N1波）潛伏期變化 造模及細胞移植術后，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長，但各實驗組N1波潛伏期短于對照組（P
2.5 SD大鼠急性脊髓損傷細胞移植后NT-3染色表達陽性的細胞數變化 造模及細胞移植術后，各組大鼠受損脊髓組織中NT-3均有明顯增高，其中術后第3天達到高峰，7 d內NT-3的表達維持在較高的水平，此后逐步減少。自術后第5天（包含5 d）開始，各實驗組與對照組比較NT-3增高顯著，差異有統計學意義（P
3 討論
治療急性脊髓損傷必須要明確其受損機制，從而針對其中的關鍵環節做出行之有效干預治療措施。急性脊髓損傷的具體機制雖尚未被完全闡明，但醫學工作者的認識逐漸趨于統一，認為脊髓損傷包括原發性損傷和繼發性損傷[4]。基于這一認識，目前急性脊髓損傷動物實驗模型基礎研究中所實驗的新方法新技術和臨床上治療脊髓損傷的各種常用措施，就是要及早正確的干預、減輕和預防可逆性的繼發性損傷，但取得的治療效果卻不甚理想。上世紀90年代初，Reynold等[5]在鼠紋狀體中發現了具有多向分化潛能、不斷進行分裂的細胞群，后來Mckay將之命名為神經干細胞（NSCs）。他們的發現顛覆了人們以往認為成年中樞神經系統神經元不能夠再生的認知，為治療脊髓損傷提供了新的治療思路―細胞移植。自此，各種細胞被嘗試用來治療神經系統損傷和脊髓損傷。在這些嘗試中，最成功的例子就是神經干細胞移植治療帕金森病、癲癇、中風等神經系統疾病[6-9]。但急性脊髓損傷的機制更加錯綜復雜，細胞移植雖然在基礎實驗研究及動物實驗等方面取得了重大進展與突破，但國內外人體臨床試驗尚未大規模開展，這仍有待于研究者的進一步地探索研究。
神經干細胞（NSCs）是一類特定的干細胞，它可以通過非對稱分裂的方式分化成為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等。此外，還可自分泌神經生長因子（NGF）、神經營養因子（NTF）等物質。自其被發現伊始，神經干細胞就被醫學工作者用來自體移植治療神經系統損傷，這樣不僅可以避免免疫排斥反應的發生，同時又解決了移植細胞的來源問題，取得了滿意的臨床療效，可作為急性脊髓損傷治療的重要參照[10]。
嗅鞘細胞（OECs）是目前所發現的極少數中樞神經系統內可以再生的細胞之一，被認為是髓鞘化能力最強的膠質細胞，其特點是具備終生再生分裂的能力，它不僅能存活于中樞神經系統當中，而且又可以促進外周神經元細胞軸突的生長。Sasaki等[11]研究就發現，嗅鞘細胞移植后能夠突出脊髓受損區達8 mm，除了仍可保持再生分裂的能力外，還可使已經脫髓鞘的神經元軸突重新髓鞘化。此外，與NSCs相似，嗅鞘細胞也能分泌多種神經營養因子，這些可能都對神經元軸突的生長起著重要的促進作用[12]。
本實驗中，采用單種細胞或兩種細胞聯合移植治療大鼠急性脊髓損傷，將能夠分泌NT-3的神經干細胞及嗅鞘細胞分別、共同移植于脊髓受損區，以期可持續分泌NT-3，這樣就可避免外源性神經營養因子半衰期短和持續性作用差的弊端，等同于NT-3、神經干細胞及嗅鞘細胞共同修復受損的脊髓，改善大鼠急性脊髓損傷后運動功能的恢復[13]。實驗中筆者觀察到，造模及細胞移植術后，24 h內各組大鼠BBB評分及改良的Tralov評分均為0分，斜板實驗角度下降非常明顯，由實驗前的（82±3.45）°降為（12.73±1.34）°，各組MEP（N1波）潛伏期明顯延長。隨著實驗的進行，各組均表現出不同程度的恢復情況，各實驗組BBB評分及改良的Tralov評分與對照組相比增高顯著（P
然而，并非所有的實驗研究都獲得了一致或相仿的研究結論。有學者認為，局部注射法進行細胞移植時，“細胞遷徙”可能是人為進行細胞移植時局部注射的壓力所導致的局部擴散而已，而不是所謂的“主動遷徙”[14]。在各種急性脊髓損傷模型中，如脊髓半或全橫斷模型，脊髓壓迫模型等，可見細胞移植無療效或療效甚微的案例，故而一部分學者對細胞移植治療急性脊髓損傷的療效抱有懷疑態度[15]。盡管如此，筆者認為急性脊髓損傷機制的復雜性決定了其治療的全面性，不是單獨應用一種治療方法或多種治療方法聯合應用就可一蹴而就的。細胞移植的方法雖然不是涉及了急性脊髓損傷修復的所有方面，但取得了一定的療效。
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[關鍵詞] 胚胎干細胞；綠色熒光蛋白；分化；角膜上皮細胞；誘導
[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03
角膜上皮位于眼角膜表面，是維持眼表正常生理功能的重要條件。健全的角膜上皮細胞是角膜抵御外界各種有害因素損傷的重要條件。人的角膜自我更新由位于角膜緣區域的角膜緣干細胞來維持，結構與功能健全的角膜緣干細胞是角膜上皮再生的主要來源，當角膜受到化學及熱燒傷，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病時，角膜緣上皮細胞將會缺失，導致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危險[1]。因此，重建完整的角膜上皮就顯得異常重要。
胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES細胞）是從早期胚胎內細胞團分離獲得的，具有體外增殖和全能性兩大特點。近年來隨著ES細胞研究的不斷深入，其逐漸應用于細胞、組織的修復和移植[2]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一種新型的報告基因，用GFP作為標志物來標記ES細胞，可用來追蹤ES細胞在體內的分化[3]。本研究利用質粒pEGFP-N1脂質體復合體轉染鼠ES細胞，并在體外誘導鼠ES細胞向角膜上皮細胞分化，為治療角膜損傷及重建角膜上皮提供細胞組織來源。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
鼠ES細胞由北京大學深圳研究生院分子生物學實驗室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巰基乙醇、非必需氨基酸，購自Sigma公司；絲裂霉素C，購自Kogyo公司；脂質體Lipofectamine 2000、G418，均購自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，購自Sigma公司；質粒pEGFP-N1，購自Clontech公司；明膠、TaqDNA 聚合酶，購自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托寶生物工程公司合成；免疫組化二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；其余為國產分析純試劑。
1.2 實驗方法
1.2.1 ES細胞的培養 ES細胞復蘇后，經絲裂霉素C滅活的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）做飼養層培養，加入預先鋪有明膠（Ⅳ型膠原）的培養皿中，37℃，50 mL/L CO2培養箱中培養，每日更換ES細胞培養液為高糖DMEM（內含0.1 mol/L β-巰基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d傳代1次。
1.2.2 轉染及誘導ES細胞 將真核細胞表達載體pEGFP-N1轉染ES細胞作為實驗組，空載質粒轉染ES細胞作為對照組。在轉染前2 h改為無血清的DMEM培養液；含載體pEGFP-N1質粒的無血清DMEM 培養液與含脂質體Lipofectamine 2000的無血清DMEM培養液混合，加入ES細胞培養皿中，置37℃的CO2培養箱中培養，換液，培養基為不含LIF的ES細胞培養基。G418篩選GFP陽性細胞克隆，接種在絲裂霉素C處理的MEF飼養層上，繼續擴增培養，獲得穩定的轉染細胞系。ES細胞誘導前去除飼養層細胞，接種于涂抹明膠（Ⅳ型膠原）的培養皿中，加入無LIF的ES細胞培養液，隔日換液，傳3～4代，誘導ES細胞分化成角膜上皮細胞。
1.2.3 形態學和免疫組織化學鑒定 顯微鏡下觀察ES細胞形態，誘導培養7 d后，細胞基本融合，將培養分化的ES細胞用PBS洗滌3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min，滴加K14、K12及CD44單抗，4℃過夜，0.02% Triton-PBS洗滌，加人生物素標記的二抗，室溫下孵育40 min，PBS洗滌數次后，加入鏈親和素一過氧化物酶溶液，放置于室溫下10 min，0.02% Triton-PBS洗滌，最后DAB顯色，顯微鏡下觀察。
1.2.4 RT-PCR檢測 Trizol R試劑盒提取ES細胞總RNA，具體過程參照Trizol Reagent說明書。引物序列分別為：CD44 正義鏈5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反義鏈5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正義鏈5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反義鏈5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正義鏈5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反義鏈5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；內參照β-actin 正義鏈5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反義鏈5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每個周期參數如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30個循環周期。采用小鼠角膜上皮細胞做陽性對照，每組PCR反應均設一個陰性對照。取RT-PCR產物20 μL行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察結果，凝膠成像系統拍照。
2 結果
2.1 ES細胞的形態
在飼養層上培養的ES細胞生長旺盛，邊界光滑，呈現巢狀生長，集落大多呈多角形或橢圓形，集落內細胞排列緊密，邊界不清；細胞邊界清，胞漿較豐富，細胞核大，核仁大。GFP陽性ES細胞在熒光顯微鏡下可觀察到細胞內有微弱的綠色熒光（圖1～2）。
2.2 誘導分化的角膜上皮細胞形態
GFP陽性ES細胞經Ⅳ型膠原誘導培養1周，可見在細胞集落中爬出上皮樣細胞， 貼壁生長，增殖迅速，逐漸呈集落式生長，生長胞體多為扁平，呈多角型或不規則形態生長，表現出典型的上皮細胞形態，在熒光顯微鏡下可觀察到細胞內有很強的綠色熒光（圖3～4）。
2.3 K12、K14及CD44表達情況
RT-PCR檢測發現：誘導分化的ES細胞中有K12及CD44表達，而K14則無表達，證實轉染后ES細胞向角膜上皮細胞方向分化（圖5）；免疫組化結果顯示：角膜上皮樣細胞K14的表達很少，而K12及CD44的免疫細胞化學染色陽性（圖6）。
3 討論
嚴重的角膜損傷一直是眼科治療的難題。一些嚴重的化學或熱燒傷，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常導致角膜上皮的大量缺失。傳統的移植方法雖有一定療效，但由于供體缺乏、移植免疫及倫理等問題，在臨床上的應用發展受到很大限制[4]。重建角膜的關鍵是獲得足夠的角膜上皮材料。本研究探索采用誘導有多向分化潛能的ES細胞向角膜上皮細胞分化，為角膜上皮移植提供無限的供體來源。
ES細胞是一種具有全能性、可無限增殖和多向分化潛能的未分化細胞，具有兩個重要特性：①自我更新潛能。干細胞在未分化狀態下可不斷增殖，從而可自我更新。②多向分化潛能。在體內外ES細胞均有分化成許多特定細胞類型的能力。它能遷移到不同部位分化成相應的細胞類型，恢復受損細胞的功能，成為一種新型細胞替代治療和基因治療的途徑。經絲裂霉素C處理的含LIF的MEF作為飼養層，能夠抑制ES細胞的分化和促進其增殖，并使其保持未分化狀態以及多向分化潛能[5]。本研究將Ⅳ型膠原作為誘導劑，加入不含LIF的培養板中，誘導體外培養的ES細胞向角膜上皮細胞分化。
GFP是一種由238個氨基酸組成的蛋白，作為熒光標記分子，在研究細胞的分化、細胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂質體方法將含有GFP的質粒轉染至小鼠ES細胞中，選擇G418篩選并純化后的GFP陽性ES細胞。將這些能夠持續表達GFP的ES細胞在誘導條件下分化成角膜上皮樣細胞，并穩定表達GFP，證明GFP基因已完全整合到ES細胞基因組中，這對ES細胞在體內的分化、遷移及整合具有重要意義。
本研究對誘導分化后的ES細胞進行了形態學觀察，發現分化后的細胞符合具有典型上皮細胞的形態學特征。細胞呈集落式生長，排列緊密，邊界不清；細胞邊界清，胞漿較豐富，細胞核大，核仁大。對于眼表上皮而言，區分角膜上皮細胞與結膜上皮細胞是非常重要的，因為它們在功能上有很大區別，影響角膜上皮組織的移植。細胞角蛋白（cytokeratin）是細胞骨架成分中間絲的重要組成部分，是一類在上皮細胞中表達豐富的蛋白質，也是某些上皮細胞重要的標志物，其中，K14主要在結膜上皮表達而不在角膜上皮表達，K12則是在角膜上皮細胞表達的角蛋白，是特異性角膜上皮細胞標志物。而CD44也存在于角膜上皮細胞中，功能與組織修復有關，它可以促進角膜上皮的愈合。本實驗誘導分化的上皮細胞CD44和K12表達陽性，而表達K14陰性，說明誘導分化的細胞是角膜上皮細胞，而非結膜上皮細胞。提示ES細胞能在體外定向誘導分化為角膜上皮樣細胞。本研究應用RT-PCR技術檢測ES細胞及分化的角膜上皮樣細胞中均有K12及CD44的表達，而結膜上皮標志物K14則無表達，證實轉染GFP后的ES細胞向角膜上皮細胞方向分化。
總之，通過以上實驗本研究成功建立了轉染GFP基因的ES細胞系，并利用Ⅳ型膠原體外誘導ES細胞定向分化為角膜上皮樣細胞，為臨床治療角膜損傷提供新的材料來源。
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如何培養適應社會需求的21世紀的新型人才，是現代高等教育所必須考慮的首要問題。因此，細胞工程作為現代生物技術學科的一個重要組成部分，在高等院校生物科學及相關專業的教學中被設定為主干課程。目前，細胞工程是生物技術等相關專業本科生培養計劃的必修課程，在課程內容上要求系統全面地介紹細胞工程的基本原理、基本技術、最新研究方法和成果、實際生產應用以及未來發展趨勢等。
細胞工程課程在生物科學專業的設置
本課程自從2007年在我校新辦生物技術專業開設以來，根據學校對本科生物技術專業的培養計劃，細胞工程是生物技術專業的主干課程，并于2009－2010學年第二學期開始開設。通過對該課程的教學，使學生掌握細胞工程所涉及的基本概念、原理、技術方法、應用基礎等內容。通過近三年的教學實踐，不斷加強課程建設與發展，理論教學體系已經基本完善，實驗教學平臺基本建立。通過全面進行教學改革，已逐漸形成本校建設的特色課程。21世紀，生命科學全面快速發展。根據學科發展和社會需求趨勢，在新辦生物技術專業基礎之上，2009年我校新辦生物科學專業。然而，新辦生物科學專業的困境是專業范圍寬泛;如何在有限的時間內，全面、高效地培養適應社會需求的合格人才，是每位任課教師和教學管理者必須認清的首要問題。為了充分發揮我們醫學院校的資源優勢，在培養學生方向定位上，以健康教育為主要方向，兼顧生物制藥等，但又與生物技術的培養方式不同。由于細胞工程是由細胞生物學、分子生物學、基因工程、工程學等學科理論技術有機結合的一門嶄新學科，因而被設定為新辦生物科學專業本科生培養計劃的必修課程。
細胞工程課程在生物科學中的開設，是以普通生物學、生物化學、醫學遺傳學、細胞生物學、分子生物學、微生物學、免疫學等先修課程為基礎。同時，將本課程的學習與基因工程、生物技術等課程的學習互相補充和相互促進，為將來從事生命科學基礎理論研究、生物制品的開發和應用、疾病診斷技術的開發與應用等領域的工作打下必要的基礎。在教材方面，以李志勇編著《細胞工程》(高等教育出版社)為基本教材，以楊吉成編著《細胞工程》(化學工業出版社)、安利國編著《細胞工程》(第二版，科學出版社)等為主要參考教材。在教師隊伍配置方面，既有細胞生物學領域教學經驗豐富的教授，也有年富力強的專業知識扎實的中青年骨干教師。細胞工程的理論教學和實驗教學全部由既具有扎實生物工程學相關知識背景，又有基礎細胞理論與實驗技術背景的骨干教師承擔。
細胞工程教學內容的設定與改革
細胞工程課程的特色，是以細胞工程技術方法的基本原理為課程教學切入點。在教學內容上，基本理論的講授與技術方法過程的介紹并重;在本學科知識的系統性方面，既有本學科理論的系統性，又加強與其他相關學科的相互滲透交叉，尤其是以細胞生物學、生物工程的基礎知識背景，為本學科的理論教學奠定基礎;通過將現有技術的原理、應用歸納，與本學科相關技術的發展趨勢講解相結合;從內容上，客觀系統地反映本學科相關領域應用前景、重點研究方向和尚待解決的科學問題;在理論上自成體系。根據教學計劃，細胞工程在我校總學時設定為80學時，其中理論50學時，實驗30學時。本課程的開設，一般在第三學年的第二學期，在普通生物學、生物化學、醫學遺傳學、細胞生物學、組織胚胎學等課程修完之后進行。細胞工程在教學內容、教學方法上又與以上學科大不相同，本課程教學是以技術方法的原理為基礎理論的學科，因此實驗與理論教學并重。細胞工程課程的理論課程內容，根據研究對象一般分為三大部分內容，分別為:細胞工程概論與基本技術、植物細胞工程、動物細胞工程。根據我校的教學實際情況和培養計劃，我們對教學內容進行了適當的改革與調整。課程的內容重點在第一部分細胞工程概論與基本技術和第三部分動物細胞工程［1－4］。
細胞工程概論和細胞工程基本技術，這部分內容是細胞工程的理論方法基礎，是教學重點之一。課程內容主要包括:細胞工程概論、細胞工程理論基礎、實驗室設置與無菌操作技術、細胞基本培養基本技術。重點讓學生掌握細胞工程研究所涉及的基本理論、技術問題。由于細胞工程是在細胞生物學教學之后開設，學生已經基本具備細胞生物學的基本理論和技術方法;因此在理論教學內容安排上，只做概要性講解。植物細胞、組織工程技術相對成熟，應用范圍廣泛。這部分內容包括:植物組織、器官培養技術;植物細胞培養技術;原生質體融合與培養技術;亞細胞水平的操作技術等。對這部分內容的教學，只做相關技術原理的理論性講解，了解相關的技術原理和應用。細胞工程課程的教學重點內容設置在動物細胞工程部分。這部分內容主要有五個方面的相關主題:①動物細胞的規模化培養技術與生物反應器;②基因操作技術與外源基因的表達，包括轉基因生物反應器(轉基因細胞和轉基因動物)、細胞培養與生物制藥;③體外受精與核移植技術，包括體外受精技術、胚胎工程技術、核移植技術等;④細胞融合與單克隆抗體技術，包括雜交瘤技術、單克隆抗體技術、抗體工程技術等;⑤胚胎干細胞與組織工程技術。在這幾個主題中，著重對細胞培養的細胞融合技術原理和基本方法，以及利用細胞融合產生雜交瘤和單克隆抗體的動物細胞工程發展的基礎進行講解;重點講解動物細胞基因表達系統和基因打靶的技術、利用染色體載體轉移基因和構建人工染色體的技術及其應用;并且對于干細胞生物學在醫學上應用的重大意義，對胚胎干細胞和組織干細胞的研究方法、研究進展進行重點講解［5－8］。
實驗教學部分，將培養胚胎干細胞的整個實驗體系與技術設定為細胞工程課程的實驗教學部分。實驗課程的教學改革，是我們對這門課程進行教學改革的重點部分，相關的研究進展將另文詳細論述。細胞工程在無論是在理論教學還是實驗教學上，都充分展現出細胞工程的最新前沿技術以及這些技術在生物制品研發、保障人類健康等方面所體現出來的越來越多的貢獻和作用。通過課程改革，不斷完善教學內容，不斷豐富教學方法與手段，使理論教學與實踐教學、甚至科研教學相互促進。通過本課程教學，使學生充分掌握細胞工程的基礎知識、基本概念和實驗技術的基本原理，完整的理論以及體外細胞培養技術和方法，以及細胞工程發展的新技術和新理論。從教學效果以及學生反饋來的信息，都證明了細胞工程教學取得了非常好的教學效果，達到了課程設定的預期目標。（本文作者：任立成、孫元田、蘇振宇、林蓉、李冬娜單位：海南醫學院生物學教研室）
關鍵詞： 脂肪源性干細胞；異種松質骨；支架材料；骨代用品；生物醫學工程；成骨誘導；種子細胞
0引言
如何獲得充足的種子細胞是長期以來限制組織工程研究的瓶頸，骨髓基質干細胞盡管已被廣泛應用于組織工程研究，但由于其干細胞含量過低、骨髓抽取量有限以及對患者造成的創傷等，使其廣泛應用到受限. 2001年Zuk等［1］從脂肪組織中成功提取了干細胞，并成功誘導其向骨、軟骨、脂肪、心肌等多個方向誘導分化. 我們將成骨誘導的脂肪源性干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）與異種松質骨支架復合，移植至兔顱骨缺損部位，以探討成骨誘導脂肪源性干細胞修復骨缺損的應用前景.
1材料和方法
1.1材料新西蘭大白兔12只，4 mo齡，體質量2.0～2.2 kg（第四軍醫大學實驗動物中心）；Dolbecco改良的Eagle培養基（DMEM），胎牛血清（FBS），地塞米松，抗壞血酸，β甘油磷酸鈉（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶（ALP）活性測定試劑盒（南京建成生物技術有限公司），牛股骨，甲醇，氯仿，300 g/L H2O2等（市售）.
1.2方法
1.2.1ADSCs的分離培養［1］將新西蘭大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取頸部后正中3 cm切口，無菌切取肩胛上脂肪組織約2 mL. 清除切取組織中肉眼可見的小血管，去除外包膜和明顯的結締組織，DHanks沖洗3遍以洗去紅細胞的污染. 切碎成糊狀，加入2 g/LⅠ型膠原酶5 mL，在37℃水浴攪拌消化40 min，過濾，加入兩倍體積DMEM培養液（含100 mL/L FBS, 1×105U/L青霉素, 1×105 U/L鏈霉素)，1000 r/min，離心10 min，傾去上層脂肪及上清，基礎培養基重懸細胞, 接種至25 cm2培養瓶內, 種植密度1.5×104/cm2. 在37℃培養箱內培養,3 d后換液，觀察原代細胞的生長. 細胞融合達90%時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.2ADSCs的成骨誘導在第1次換液時將部分細胞改為成骨誘導培養液(基礎培養液加10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β甘油磷酸鈉，50 mg/L抗壞血酸［1］)培養. 細胞融合達90%時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代.
1.2.3ALP活性測定將第2代ADSCs以5×103/孔的密度接種于96孔板中,成骨誘導培養液誘導0，3，6，9，12，15 d后,PBS漂洗,加入50 μL細胞裂解液4℃過夜, ALP活性測定試劑盒檢測ALP活性.
1.2.4茜素紅染色取成骨誘導1 wk的細胞爬片培養1 wk,PBS沖洗3遍，950 mL/L乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗3次，1 g/L茜素紅于37℃染色30 min，蒸餾水沖洗，干燥，封片.
1.2.5松質骨支架的制備取市售牛股骨，將股骨頭松質骨加工成直徑10 mm，厚2 mm的骨片. 將骨片置入1∶1的甲醇∶氯仿100 mL中脫脂24 h，12 h換液1次，蒸餾水沖洗. 將脫脂后的骨片置入300 mL/L H2O2 100 mL中脫蛋白48 h，每12 h換液1次. 蒸餾水沖洗. 將脫脂、脫蛋白后的骨片置入0.6 mol/L的HCL中脫鈣5 min，蒸餾水沖洗. 將脫脂、脫蛋白、脫鈣后的松質骨片低溫晾干，密封包裝，Co60滅菌備用. 種植細胞前將成品松質骨無菌條件下PBS液中浸泡7 d，分別在基礎培養液和誘導培養液中浸泡3 d.
1.2.6細胞的種植及檢測將ADSCs和成骨誘導15 d的ADSCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心，分別用基礎培養液和誘導培養液懸浮,調整細胞密度至1×1010/L. 將基礎培養液和誘導培養液中浸泡的松質骨支架轉移至24孔培養板中，分別種植上述細胞懸浮液100 μL，置37℃培養箱內6 h使細胞貼壁，然后分別加入基礎培養液及誘導培養液培養. 將復合后培養5 d的細胞支架復合物固定，干燥，噴金，掃描電鏡觀察. 復合培養7 d后手術植入顱骨缺損部位.
1.2.7動物分組及處理將12只大白兔按0.2 mL/kg速眠新麻醉，取雙側顱骨直徑10 mm鉆孔，24孔分為4組，每組6孔. ① 支架+成骨誘導ADSCs（A組）；② 支架+ADSCs（B組）；③ 單純支架（C組）；④ 對照組（D組）. A，B組植入上述成骨誘導和未誘導的脂肪源性干細胞復合異種松質骨支架，所用細胞均為自體細胞；C組植入單純的松質骨支架，為前述松質骨成品PBS液中浸泡7 d，9 g/L NaCl溶液中浸泡3 d后植入；D組不做處理. 術前術后肌注慶大霉素，2萬U/kg. 術后14 wk用過量戊巴比妥鈉麻醉處死動物，取材，X線攝片，計算成骨面積，HE染色行組織學分析.
統計學處理：數據以x±s表示,應用SPSS醫用統計軟件包進行OneWay ANOVA檢驗. P<0.05為差異具有統計學意義.
2結果
2.1細胞培養原代脂肪源性干細胞呈梭形，在β甘油磷酸鈉，地塞米松，抗壞血酸的誘導下，能向成骨方向分化（圖 1A）. 誘導2 wk后茜素紅染色陽性，提示有鈣結節形成(圖1B). ALP活性檢測結果顯示，成骨誘導6 d后，支架+成骨誘導ADSCs組與對照組間差異具有統計學意義（P<0.05，表1），支架+成骨誘導ADSCs組的ALP活性明顯高于單純支架組.表1不同時期對照組和成骨誘導組堿性磷酸酶含量
