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開篇：寫作不僅是一種記錄，更是一種創造，它讓我們能夠捕捉那些稍縱即逝的靈感，將它們永久地定格在紙上。下面是小編精心整理的12篇核酸檢測方法，希望這些內容能成為您創作過程中的良師益友，陪伴您不斷探索和進步。
關鍵詞：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；檢測
中圖分類號：S854.43 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）04-0005-03
高致病性禽流感是一種嚴重危害養禽業發展的烈性傳染病，被OIE列為必須通報的傳染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，AIV除了可感染禽類外，部分亞型還可感染人、豬、馬等。AIV基因組由包括基質蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神經氨酸酶（NA）基因在內的8個負鏈單股RN斷組成，其中M基因組序列高度保守，HA基因組變異性最強，NA基因組變異次之。HA基因和NA基因某些位點的變異可導致不同的HA亞型和NA亞型[1]，目前發現AIV有16個HA亞型和10個NA亞型，其中H5、H7亞型常表現為高致病性，除了給養禽業帶來嚴重經濟損失外[2]，還可感染人，甚至導致死亡[3]。目前，病毒分離、血清學試驗仍是診斷AI和對AIV進行定型普遍采用的方法，但病毒分離不僅操作繁瑣、復雜和耗時，難以對AI進行快速診斷，還存在潛在散毒的危險。PCR方法是一種基因體外擴增技術，可以在數小時內對某片斷基因擴大數百萬倍。該技術具有特異性強、敏感性高、檢測快速等特點，已廣泛應用于生物學、醫學、獸醫學的各個領域。多重分型PCR是一種特殊PCR形式，其最突出的特點是一次反應可以達到既分型又能夠鑒定亞型的目的，在A、B、C三種流感及其他病源混合感染的鑒別診斷上具有獨特優勢和很高的實用價值[4，5]。根據RT-PCR技術的原理，研究建立了鑒定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技術。
1 材料與方法
1.1 試驗用材料
AIV H5N1抗原，購自哈爾濱維科生物技術開發公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV），本室留存。
1.2 生化試劑
Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，內含Mg2+）、RNA酶抑制劑、反轉錄酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取液購自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亞砜購自上海生工生物工程有限公司。
1.3 引物設計及合成
參考基因庫中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，經Clustalx序列軟件比對后，選擇在保守區域用Primer Primer5.0軟件設計了3對引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4 病毒RNA的提取
（1）1.5 mL離心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL樣品，混勻，室溫放置5 min。
（2）加入120 μL -20℃預冷的氯仿，混勻，室溫放置3 min。
（3）12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，取上清120 μL于另一離心管中，加120 μL -20℃預冷異丙醇，室溫放置5 min。
（4）12 000 r/min， 4 ℃離心10 min，棄上清，加入600 μL -20 ℃預冷75%乙醇，上下顛倒，12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，棄上清。室溫放置約3 min近干燥。
（5）加20 μL 0.1% DEPC處理過的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存備用。
1.5 多重RT-PCR
采用總體積為50 μL的多重PCR反應體系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反轉錄酶（AMV）1 μL，二甲基亞砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC處理過的水補足至50 μL。振蕩離心混勻后，在PCR儀上設定程序進行擴增，通過對反轉錄條件及多重PCR變性、退火、延伸的溫度和時間以及循環次數等的優化，最終確定其反應參數為50 ℃反轉錄30 min，94 ℃預變性2 min后，進入94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃結束多重PCR擴增。
1.6 PCR產物分析
取7 μL多重PCR產物與2 μL Loading Buffer上樣緩沖液混合，在1.5%瓊脂糖凝膠上以100 V電壓進行電泳28 min，然后置數碼凝膠系統觀察拍照，分析記錄結果。
回收、純化229、380、878 bp的cDNA擴增片段，送上海生工生物工程有限公司進行測序，并用DNAStar基因分析軟件分析測序結果。
1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性試驗
用建立的多重RT-PCR 反應體系對10倍系列稀釋的禽流感H5N1抗原進行檢測，檢驗該體系對各稀釋度抗原模板的敏感度。
1.8 委托樣本的檢測
用建立的多重RT-PCR 反應體系對5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本和360份禽咽肛拭子盲樣進行檢測，與出口檢疫正式采用的熒光RT-PCR檢測方法比較。
2 結果
2.1 多重RT-PCR特異性試驗
經多重RT-PCR擴增，其產物與DNA分子量標準比較，顯示H5N1抗原擴增出380、878、229 bp3條帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴增出M1cDNA1條帶，NDV、IBV、EDSV則無條帶呈陰性，與理論預期值一致（圖1）。
2.2 H5N1多重RT-PCR敏感性試驗
對禽流感H5抗原做HA試驗，病毒滴度為1：256。抗原分別做10倍系列稀釋，10-1、10-2、10-3倍抗原稀釋液多重RT-PCR檢測結果陽性；抗原做10-4及以上倍數稀釋，多重RT-PCR檢測結果陰性。敏感度試驗表明，多重RT-PCR 對抗原的最低檢測稀釋度為10-3，是一種較為靈敏的檢測方法（圖2）。
2.3 委托樣本的檢測
5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本檢測結果顯示，僅擴增出229 bp M1cDNA1條帶，360份禽咽肛拭子樣本則無條帶呈陰性，與熒光RT-PCR 方法檢測結果一致，符合率達100%，說明該多重RT-PCR方法可以用于基層動物防疫和監督部門的檢測。
3 討論
AIV H5亞型不僅感染家禽，引起大批死亡，造成嚴重的經濟損失，還可感染其他動物和人，有重要的公共衛生意義。傳統的病毒分離和血清學試驗無法對流行的AIV亞型進行快速檢測鑒別。本試驗根據AIV 基因易變異的特性及多重分型PCR引物設計原則，參考基因庫中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分別針對H5、N1和M1基因設計了3對特異性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1為分別針對H5、N1亞型的特異性引物，能夠分別特異性地檢測相對應的亞型。利用這3對引物，通過對多重RT-PCR擴增條件的優化，建立了快速檢測鑒定AIV H5亞型的多重RT-PCR分型技術。
該多重RT-PCR分型方法檢測結果顯示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同時出現3條cDNA擴增帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴增出M1 cDNA 1條帶，傳染性支氣管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和減蛋綜合征病毒則呈陰性。多重RT-PCR 敏感性試驗結果表明，H5N1抗原最低檢測稀釋度為10-3。H5亞型特異性試驗結果表明，僅H5呈陽性，其他H6、H9亞型和NDV、IBV、EDSV均呈陰性。對所擴增片段進行回收、純化并測序，其測序結果經DNAStar基因分析軟件分析，這些片段分別與AIV HA基因、NA基因和M基因有著高度同源性，提示這些擴增基因的序列與原參考序列的基因來源一致，即分別來源于AIV的H5亞型HA基因、NA基因和M基因，表明該多重RT-PCR分型方法具有高度特異性。
同時，該多重RT-PCR分型法不需要進行多次PCR擴增，在數小時內就可完成對AIV H5亞型的快速檢測鑒別，能夠在分型同時一步鑒定到亞型，達到快速診斷和鑒別AIV的雙重目的，對及時有效控制AIV感染有重要意義，對AIV H5亞型感染制定有效的防制措施具有實用價值和指導意義。
參考文獻：
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關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；病毒分子；生物學檢測方法
中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）12- 0110-02
豬傳染性胃腸炎（TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）導致豬出現脫水、水樣腹瀉以及嘔吐等為主要臨床癥狀的高度傳染性疾病，該病在春季、初秋以及冬季具有較高的發病率[1]。豬傳染性胃腸炎最早發生于美國，隨后在世界各地均有發生，我國于20世紀50年代首次發現該病，目前全國大部分地區均發生過豬傳染性胃腸炎。不同日齡和品種的豬均可以感染傳染性胃腸炎，其中以15日齡左右的仔豬發病后死亡率最高，高達100%；5周齡以上的仔豬感染傳染性胃腸炎后死亡率較低，但是會影響仔豬后期的生長，降低仔豬的飼料利用率。目前，該病已被世界動物衛生組織列為B類必檢傳染性疾病。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，該技術已經廣泛用于各種細菌性和病毒性疾病的檢測[2]。本文綜述了分子生物學技術在傳染性胃腸炎中的應用，以期能為從事傳染性胃腸炎診斷和防控的工作者提供幫助。
1 傳染性胃腸炎病毒基因組結構和基因表達方式
1.1 TGEV基因組結構 傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，該病毒的基因組不分節段、單股正股RNA，具有高度傳染性。傳染性胃腸炎基因組全序列分為7個區29kb，結構序列為5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且該基因組的3'-末端以共價鍵結合的poly結構，5'末端有帽結構[3]。基因組1約有20kb，主要負責病毒的編碼，其余基因均在近3'端。傳染性胃腸炎病毒全基因組編碼由4種結構蛋白和3種非結構蛋白組成，其中基因7、基因3和基因1為非結構蛋白，N、M、sM、S為傳染性胃腸炎的結構蛋白。
1.2 基因表達方式 傳染性胃腸炎病毒在胞漿脫殼以后，其正鏈RNA就呈現了mRNA的功能，使基因1轉錄表達RNA聚合酶，同時該基因有作為模板合成負鏈RNA，進而親代RNA與負鏈RNA形成雙鏈復制中間體。因此，在感染傳染性胃腸炎病毒的細胞內，可以檢測出不完全RNA、基因組RNA、mRNA以及雙鏈中間體4個特異性RNA，這可以作為豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學檢測指標之一[4]。
2 結構蛋白及功能
豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白主要為S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是豬傳染性胃腸炎病毒纖突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，該蛋白基因全長4.3kb，蛋白分子量為195～220ku；S蛋白不僅是決定豬傳染性胃腸炎病毒抗原的重要結構，也影響著病毒對細胞的致病性、親嗜性等。M蛋白是構成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前體是由膜外區、信號肽、極性區、跨膜區突于病毒粒子內C-端區等功能區域構成，分子質量為29～31ku；M蛋白不僅決定了病毒粒子的出芽位點和裝配位點，也可以影響病毒變異。N蛋白是一種酸性蛋白質，分子量為47KDa，含有382個氨基酸殘基，該蛋白不僅是豬傳染性胃腸炎病毒的結構蛋白，同時對病毒基因組的加工、復制都具有重要作用。sM蛋白分子質量為78ku，含有1種小膜蛋白和82個氨基酸殘基，該功能蛋白在抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的體液和細胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物學檢測方法
3.1 核酸探針 核酸探針檢測方法的基本原理是利用核苷酸堿基互補，在堿基互補過程中，采用標記物標記與被檢測靶序列互補的單鏈核酸分子，進而檢測到目的核序列。該檢測方法與掃描電鏡、熒光抗體試驗、病毒分離等相比，具有較好的特異性，并且可以實現快速檢測的目的。現代研究表明[6]，不同的病毒探針可以分別擴增出與其對應的病毒模板，對其他病毒模板影響不大，同時核酸探針擴增的最低檢測限為3 000～6 000個拷貝的單個病毒核酸，具有較高的特異性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 該檢測方法使用的首要條件是知道被檢測病原的相關目的基因序列，根據相關目的序列后，采用相關軟件設計相應的引物，然后進行體外擴增目的基因，進而達到檢測的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法檢測豬傳染性胃腸炎病毒，并采用相同濃度做重復性檢測，結果顯示RT-PCR擴增的特異性條帶為590bp左右；然后又以豬瘟病毒、豬細小病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬偽狂犬病病毒以及豬輪狀病毒做特異性試驗，結果顯示僅有豬傳染性胃腸炎病毒得到了特異性目的條帶，所以RT-PCR檢測方法對豬傳染性胃腸炎病毒檢測具有較好的重復性和特異性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR檢測方法是以普通PCR為基礎發展的一種新型檢測方法，該檢測方法可以在一個PCR反應體系中加入多對引物，并通過采用優化后的PCR反應條件，達到同時檢測多種病原的目的，具有快速、成本低等優點，目前也常用于各種疾病的診斷。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法檢測傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、嵴病毒和A群輪狀病毒的方法，并對該檢測方法進行了敏感性試驗和特異性試驗，結果顯示，多重RT-PCR法可以檢測出50TCID50的混合病毒，且能擴增出長度為275bp、544bp、750bp的3條特異性片段，具有較高的特異性和敏感性，可以在臨床上推廣使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要設計內、外2對引物，并通過2次擴增對樣品進行檢測，該方法相對其他PCR檢測方法，具有較高的敏感性，且節約成本。現代研究表明，PCR技術在檢測病毒時，可以省略不同病毒分離的過程，具有較高的敏感性和特異性，而套式PCR方法在病毒粒子較少的情況下依然能夠檢測出，表明套式PCR比常規PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR檢測豬呼吸道冠狀病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的S基因序列，根據兩組病毒的基因序列分別設計了2對引物，然后分別以豬呼吸道冠狀病毒細胞和豬傳染性胃腸炎病毒細胞為模板進行套式PCR特異性片段擴增，結果顯示，豬呼吸道冠狀病毒擴增的基因片段為214bp，豬傳染性胃腸炎病毒擴增的基因片段為886bp，同時檢測出了這種病毒，具有較高的特異性和敏感性。
3.5 熒光定量RT-PCR方法 熒光定量RT-PCR檢測方法的原理是在PCR反應體系中采用熒光探針標記法或加入了SYBR GreenI熒光染料標記PCR的反應產物，然后使用反應儀器收集反應產物的熒光信號，并根據熒光信號的強弱確定產物的量，進而達到與起始模板準確定量的目的。該檢測方法與常規RT-PCR相比，不需要進行電泳試驗檢測PCR反應產物，反應結果更為直觀、方便，同時又避免了因電泳試驗對環境造成污染。王建中等[10]根據豬傳染性胃腸炎病病毒的S基因序列設計了引物，并通過多組試驗對熒光定量RT-PCR反應條件進行優化，結果顯示，優化后的檢測方法對其他病原的檢測結果均為陰性，檢測結果的敏感性高達43.07拷貝/μL，是常規PCR檢測方法的100倍，具有較高的敏感性和特異性。
3.6 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增技術是近幾年新興的一種分子生物學檢測方法，因其具有特異性強、敏感性高、檢測速度以及操作簡單等優點，目前已經廣泛應用于病毒病和細菌病檢測。高睿澤等[11]根據豬傳染性胃腸炎病毒的N基因建立了環介導等溫擴增快速檢測方法，并對該檢測方法的敏感性和特異性進行了評價，結果顯示，該方法在63℃下可以使豬傳染性胃腸炎病毒N基因獲得較高的特異性擴增，且與豬流行性腹瀉病毒等物交叉反應，具有加高的特異性；同時該檢測方法可以檢測到131.4fg/μL的DNA，其靈敏度比常規PCR高出3個數量級。
參考文獻
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關鍵詞：食品安全；現代檢測技術；食品檢測
1引言
近年來，食品安全問題逐漸成為全球關注的焦點之一。危及人類健康和生命安全的重大食品安全事件屢屢發生，從歐州的瘋牛病、二惡英到我國的蘇丹紅、瘦肉精和三聚氰胺等令人防不勝防。新技術的發展、農用化學品的濫用，養殖業的不規范用藥以及環境的污染等都是造成食品安全問題的原因，因此加強食品安全檢測是解決食品安全的重要措施。傳統的食品檢測方法已不能滿足人們對食品安全的需求，因此，新的檢測技術應運而生。現代食品檢測技術主要通過儀器分析、分子生物學等方式對食品進行科學檢測，能夠對食品中含有的有害物質、微生物及食品轉基因等問題進行檢測，從而及時采取合理措施對問題食品進行處理，保障社會中食品使用的安全。
2現代檢測技術
2.1熒光定量PCR檢測技術
熒光定量PCR檢測技術是在常規PCR的基礎上運用熒光共振能量轉移技術，把核酸擴增、雜交、檢測等技術結合在一起，在PCR指數擴增期間通過連續監測熒光信號的強弱來即時測定特異性產物的量，據此計算待檢樣品中目的基因的拷貝數。熒光定量PCR標記的方法由最初單一的染料法，發展到特異性更高的探針法。
熒光定量PCR技術自產生以來，經過不斷的發展完善，已廣泛應用于食品中致病微生物的檢測。李光偉等[1]采用沙門氏菌fimY基因序列，設計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門氏菌的熒光定量PCR檢測方法。胡建華等[2]根據GenBank公布的志賀氏菌ipaH基因的保守序列設計特異性引物，篩選合適的DNA 模板制備方法，以熒光定量PCR檢測方法與常規PCR檢測方法結合，檢測培養液和牛奶陽性樣品中的志賀菌目。
同時，熒光定量PCR技術是檢測轉基因食品最可靠、最快捷的方法，基于轉基因特異DN段的熒光定量PCR篩選方法已被一些國家作為相關食品法規的標準檢測方法。吳志毅等[3]采用普通PCR法和熒光定量PCR法對Bt63轉基因大米的檢測靈敏度進行對比研究。根據大米內源蔗糖磷酸合成酶基因SPS和結構特異性基因Btc的基因序列，選用特異性的引物和探針進行研究，經驗證試驗表明具有專一性，能用于品系鑒定。在靈敏度試驗中，陽性轉基因大米按照不同質量百分比進行梯度稀釋，提取DNA進行PCR擴增。結果表明：普通PCR檢測的靈敏度在0.1%左右，而熒光定量PCR檢測的靈敏度為0.01%，是普通PCR檢測的10倍以上。
2.2核酸探針檢測技術
核酸探針檢測技術的原理是堿基配對、互補的兩條核酸單鏈通過退火形成雙鏈，這一過程稱為核酸雜交。核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品定基因序列的檢測。每一種病原體都有獨特的核酸片段，通過分離和標記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷及食品安全等研究，該技術具有特異性好、靈敏度高的優點。
在食品檢測中，核酸探針檢測技術主要用于致病性病原菌的檢測。核酸探針可用于檢測任何特定的病原微生物，并能鑒別密切相關的毒株，因此可廣泛應用于進出口動物性食品的檢驗，包括沙門氏菌、彎桿菌、輪狀病毒、狂犬病毒等多種病原體[4]。但核酸探針技術在實際應用中仍存在一些問題，如放射性同位素標記的核酸探針半衰期短，對人體有危害，操作技術復雜，使用費高等缺點，所以多作為實驗室診斷手段。
2.3酶聯免疫吸附技術
ELISA是一種把抗原和抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的檢測技術。基本原理是，使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。
ELISA已廣泛應用于食品安全檢測的各個領域。在致病微生物檢測方面姚斐等[5]用間接ELISA可快速有效檢測出活的非可培養狀態的大腸桿菌O157：H7。此外，采用Dot-ELISA檢測沙門氏菌，耗時短，比傳統方法快4～6d，這都表明了ELISA可以快速的檢測出食品中的致病微生物。
在農藥殘留檢測方面，余向陽等[6]以辣根過氧化物酶對兔抗擬除蟲菊酯類農藥抗體進行標記，建立了檢測蔬菜中多種擬除蟲菊酯類農藥的直接競爭抑制ELISA方法，用該方法對南京市場107個樣品檢測的陽性檢出率明顯高于氣相色譜法。賀亮[6]建立了直接競爭ELISA檢測磺胺二甲嘧啶殘留方法，該方法最小檢出量為1.97ng/mL，檢測范圍5～200ng/mL。現已開發的商業化酶聯免疫ELISA檢測試劑盒，可快速定性、定量檢測動物組織、雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清等樣品中磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺嘧啶（SD或SDZ）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺噻唑（ST）藥物的殘留量。
ELISA已用于檢測食品中毒素。黃曲霉毒素是一種致癌性很強的真菌毒素，各國都嚴格限制其在食品中的含量，其中B1的毒性最強。蔣建云等[7]利用ELISA法的AFB1試劑盒，通過抗黃曲霉毒素B1抗體與酶標抗原、待測抗原的競爭免疫反應以及酶的催化顯色反應相結合來檢測黃曲霉毒素B1的含量。該方法具有分析速度快，提取和純化步驟簡便，準確度高、成本低、污染少，一次可測定大批量標本等優點。
2.4高效液相色譜～質譜連用技術
HPLC-MS技術是將液相色譜與質譜串聯成為一個整機使用的檢測技術，它以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統。樣品在質譜部分和流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按質量數分開，經檢測器得到質譜圖。液質聯用體現了色譜和質譜優勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優點結合起來，在食品安全檢測領域得到了廣泛的應用。
HPLC-MS技術在食品安全方面的應用主要集中在食品中農藥、獸藥殘留和非法添加物的檢測。王鳳池[8]建立了通過固相萃取（SPE）-HPLC-MS/MS技術同時測定腸衣品中8種硝基咪哇類藥物殘留量的方法。樣品經乙酸乙醋提取，經SCX固相萃取柱凈化后，通過HPLC-MS/MS測定，8種分析物在0.1、0.5和1μg/kg 3個水平的回收率在87.3%～117%之間，重復性在3.35%～10.1%，8種分析物的檢出限為0.049～0.083μg/kg。黃芳等[9]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色譜-質譜測定方法，用Kromasil C18 柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為5%乙腈：95%水（含0.1%甲酸），采用正離子模式的電噴霧質譜檢測，線性范圍為0.01～0.5mg/L，檢出限0.01mg/L，回收率為80%～99%。
2.5近紅外光譜技術
現代近紅外光譜技術是將光譜測量技術、計算機技術、化學計量學技術與基礎測試技術有機結合，以無損檢測為優勢的分析技術。近紅外光是介于可見光和中紅外光之間的電磁波，近紅外光譜區與被測物質中O-H、N-H、C-H 及S-H 等含氫基團的分子內部原子間振動的倍頻和合頻的吸收區一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，能得到其中有機分子含氫基團的特征信息[10]。不同物質在近紅外光譜區因成分不同而存在特定的吸收特征，這為近紅外光譜定量或定性分析物質提供了理論依據。
近紅外光譜技術具有無損性、前處理操作簡便、檢測成本低、反應迅速等特點使其在食品安全檢測中的應用日益廣泛。Kawasaki等[11]構建了基于近紅外光譜技術的牛奶品質檢測模型，該模型可較好地檢測牛奶的各項理化指標，評價牛奶的品質。屠振華等[12]運用近紅外光譜技術，結合模式識別法對蜂蜜摻假進行了識別分析，分別采用偏最小二乘判別分析、獨立軟模式法等方法進行蜂蜜摻假識別模型的建立和樣品檢測，結果表明該方法的正確判別率達100%。Liu等[13]采用表面增強拉曼光譜建立了蘋果和番茄表面西維因、亞胺硫磷、谷硫磷殘留的檢測方法，采用偏最小二乘法和主成分分析法建立這3種農藥的定性和定量模型對光譜數據進行校正處理，處理后西維因、亞胺硫磷和谷硫磷這3種農藥在蘋果上的檢出限分別為4.51、6.51、6.66mg/mL，在番茄上的檢測限分別可達5.35、2.91、2.94mg/mL，方法回收率可達78%～124%，所建立的方法可以有效檢測水果和蔬菜中的農藥殘留。
3結語
隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，食品安全越來越受到大家的關注。食品安全關乎國計民生，政府機構應制定切實可行的食品安全政策法規，建立健全市場監管機制，加強消費者的食品安全意識。同時，必須大力發展食品安全檢測技術，完善檢測體系，為食品的安全和品質監管作出更大的貢獻。
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2009年，我國各行各業人士都在為抗擊甲型H1N1流感做著力所能及的事情，中科院廣州生物醫藥與健康研究院的科研人員則為對抗甲流研制了核酸檢測生物傳感器。據團隊負責人曾令文教授介紹，甲型H1N1流感是一種急性呼吸道傳染病，其病原體是一種新型的H1N1流感病毒，而核酸生物傳感器對這種病原體具有特異性的快速應答效應，非常適合用于初篩工作。
自此之后，曾令文團隊便開始致力于生物傳感器研究，不久前他們又成功開發出了基于核酸等溫鏈置換反應技術與膠體金技術的核酸檢測生物傳感器，研究成果已在英國皇家化學雜志《化學通訊》上發表。據曾令文教授介紹，新型的核酸檢測生物傳感器靈敏度高，一次反應最低可以檢測出6個待檢核酸，同時特異性也很高，除了可以檢測特異性病原體核酸外，也能區分單核苷酸突變，且簡單、快速，不需要復雜儀器支持，僅需30分鐘，肉眼就能見到所出的結果。
曾令文教授表示，核酸檢測生物傳感器適用于各種各樣的基因檢測，既能用于遺傳性疾病基因缺失突變檢測（如地中海貧血），也能進行疾病和藥物易感基因檢測（如SNP檢測和耐藥檢測），還能用于癌癥基因突變檢測（如K-ras突變檢測），以及用于個體化治療基因檢測（如腫瘤個體化用藥指導）等。目前，該生物傳感器已經在醫院進行了實驗驗證，用它檢測出的結果與醫院常規檢測方法檢測出的一致。
任何科研成果的研發過程必定與困難相伴，核酸檢測生物傳感器同樣如此。曾令文團隊在研發該生物傳感器過程中，就曾遇到特異性、交叉反應以及檢測線不出線等問題。他說：“特異性是分子檢測方法中的重點，所以我們在設計反應體系中發夾結構時，必須準確設計莖與環的堿基比。因為，當待檢測核酸存在時，待檢測核酸與環的結合力比其與莖的結合力強，才能把發夾結構打開，所以環要足夠長，但太長又會降低反應的特異性。為了解決這些問題，我們進行了無數次比對和實驗。”
近年來，我國分子生物學技術有了突飛猛進的發展，并帶動了整個生物科學的全面發展，與國際先進水平之間的差距正在逐步縮小，甚至部分研究已經處于國際領先水平。但曾令文教授認為，我們還應該在源頭創新方面不斷努力。他說：“創新是科學的靈魂，對于分子生物學研究而言，除了了解學術動態之外，我們還應該解放思想，善于總結經驗，并將經驗上升到理論層面，提高理論修養，增強分辨能力和表達能力，并敢于堅持真理。”
此外，曾令文教授還表示，分子生物學的發展離不開優秀的團隊，因此如何科學管理團隊也顯得非常重要。“科研團隊的管理是對知識生產過程中的社會活動的管理，它不同于其他管理，科研活動具有較大的靈活性和不確定性，科研管理是對以探索性、創造性為主的腦力勞動的管理，工作過程中出現的問題也是難以預測的。”曾令文教授認為，只有富含創新熱情，擁有良好學習氛圍，有一定產出，且成員之間相互交流與合作的團隊才能被稱為優秀團隊。
目前，曾令文團隊又瞄準了人類重大疾病分子診斷技術以及獸藥殘留、生物毒素和重金屬等食品安全和環境污染檢測技術的研究。他說：“開發人類重大疾病分子診斷技術，有利于疾病診斷及指導臨床用藥。而食品安全及環境污染檢測技術關系到國計民生和人民健康，我們希望通過努力開發出具有自主知識產權的新型分子診斷技術，為更多人的健康保駕護航。”
關鍵詞：現代 生物檢測技術 食品檢驗
1.現代生物技術在食品檢驗中應用的意義
食品檢驗檢測對于保障食品安全、促進食品生產水平都起著及其重要的作用。長期以來獲得廣泛應用的物理、化學、儀器等檢測方法，由于存在某些局限，已不能滿足現代食品檢測的需要，隨著生物技術的發展，人們已逐步認識到生物技術在食品檢驗中的重要作用及其意義。
生物技術檢測方法以自身獨特優勢在食品檢驗中顯示出巨大的應用潛力，其應用幾乎涉及到了食品檢驗的各個方面，包括食品的品質評價、質量監督、生產過程的質量監控及食品科學研究。
生物技術檢測方法不僅具有特異的生物識別功能、極高的選擇性，而且它可與現代的物理化學方法相結合，產生一些簡單、結果精確、靈敏、專一、微量和快速、成本低廉的檢測方法，因此其在食品檢驗中占有越來越重要的地位。
2.在食品檢驗中應用的幾種生物檢測技術
2.1 免疫法
免疫法是最靈敏的生物檢測方法，具有高特異性和高靈敏性（靈敏度可達1ppb，1ppm）、操作簡便、再現性好，應用前景看好。用免疫法可進行蛋白質檢測，由于不同蛋白質的物理、化學性質差別極小，只能通過各種免疫方法或標記探針法加以區別。
2.1.1 熒光抗體法
將熒光抗體溶液滴加于固定的標本上，一定時間后用緩沖液沖洗，若有相應抗原存在，即與熒光抗體結合，在熒光顯微鏡下即可看到發熒光的抗體復合物。熒光抗體法在微生物污染鑒定中經常使用，最常用于沙門氏菌的檢測。
2.1.2 放射免疫法
靈敏度高，但操作相對復雜，放射免疫法同位素半衰期短，保存及操作不便。目前應用情況受到限制。
2.1.3 酶聯免疫吸附法
是一種基本的酶免疫檢測方法，其選擇性好、靈敏度高、快速、易操作、結果判斷客觀準確、實用性強。酶免疫法和其他免疫法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結合為基礎的。以酶或輔酶為標記物，標記抗原或抗體，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。
酶聯免疫吸附法除可檢測食品中的毒素、殘留農藥及微生物外還可用于營養素的測定。
2.1.4 凝集反應法
當有電解質存在時，顆粒狀的抗原與其特異性的抗體結合并生成可見凝集塊的反應稱為凝集反應，有直接反應和間接反應法。利用凝集反應可測定抗體的效價，也可用于細菌、病毒等的分類。
2.1.5 沉淀反應法
沉淀反應法常見的是一種瓊脂擴散試驗。單向擴散是利用不同抗原抗體在瓊脂中不同的擴散速度而會在瓊脂中出現幾條相互分離的沉淀帶。雙向擴散則是利用抗原抗體都向中間層―――瓊脂擴散而形成沉淀帶，根據分離沉淀帶的數量可確定抗原抗體種類。
2.1.6 免疫擴散法
利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用，使抗原和抗體在濃度比例合適的部位產生沉淀帶或沉淀環，從而檢測蛋白質。如血清中IgG、IgA、IgM含量的測定。
2.1.7 免疫電泳法
免疫電泳法是將電泳和瓊脂擴散沉淀反應相結合的一種方法，即先將血清或蛋白質抗原在瓊脂凝膠中進行電泳。帶電的蛋白質抗原向負極移動，加入抗血清后，不同區點的抗原再與抗體進行沉淀，當相應抗原抗體接觸，在適當比例下形成弧形沉淀帶，根據沉淀帶的位置對蛋白質的各組分進行檢測。如免疫球蛋白含量的測定。
2.2 酶檢測法
酶檢測法就是用酶來測定某些用一般化學方法難于檢測的食品成分的含量或測定食品中某些特殊酶的活性或含量。其最大特點就是特異性強。所以常用于分析結構和物理化學性質比較相近的同類物質的分別鑒定。如測定食品中殘存有機農藥的含量、微生物污染或了解食品的制備、保存情況。
酶檢測法的樣品一般不需要進行很復雜的預處理，由于酶的催化效率很高，反應條件溫和，酶檢測法的檢測速度也比較快。常用的有以下方法：
2.2.1 終點測定法
在以待測物質為底物的酶反應中，如果使底物能夠接近完全地轉化為產物，而且底物或產物又具有某種特征性質，通過直接測定轉化前后底物的減少量、產物的增加量或輔酶的變化等就可以定量待測物質。
2.2.2 動力學測定法
在反應體系中精確加入一定數量的酶，測定反應物或產物變化的速度。測定的參數可以是吸光度、熒光度、pH值等。
2.2.3 多酶偶聯測定法
當被測定的底物或反應產物沒有易于檢測的物理化學手段時，可采用兩種或兩種以上的酶進行連續式或平行式的偶聯反應，使底物通過兩步或多步反應，轉化為易于檢測的產物，從而測定待測物質的含量。例如葡萄糖的定量測定。
2.2.4 利用輔酶作用或抑制劑作用測定法
如果待測物質可作為某種酶專一的輔酶或抑制劑，則這種物質的濃度和將其作為輔酶或抑制劑的酶的反應速度之間有一定關聯，因此通過測定該酶的反應速度就能進行這種物質的定量。嘌呤、核甙酸、維生素、輔酶及食品中農藥、殺蟲劑的檢驗可用此法。
2.2.5 通過酶反應循環系統的高靈敏度測定法
對于極微量的物質進行酶法檢測時，由于靈敏度的原因，在很多情況下不能應用通常的終點測定法，可設計一個酶反應循環系統來提高檢測靈敏度。
2.2.6 酶標免疫檢測法
抗體與相應的抗原具有選擇和結合的雙重功能。若要測定樣品中抗原的含量，就將酶與待測定抗原的對應抗體結合在一起，制成酶標抗體。然后將酶標抗體與樣品液中待測抗原，通過免疫反應結合在一起，形成酶―抗體―抗原復合物，通過測定復合物中酶的含量就可得出待測抗原的含量。此法可用于食品的污染檢測，尤其適用于毒素的快速檢測。
2.2.7 放射性同位素測定法
酶的活性可以采用同位素標記的底物進行測量。經酶解后隨時間所生成的放射性產物含量與酶的濃度成正比。也可用放射性同位素的底物在酶的作用下得到的產物，分離測定產物的同位素含量。此法可用于需要進行極微量的分析或因新發現的酶還未找到適當的分析法時的測定。
2.4 核酸探針技術
核酸探針技術又名基因探針技術或核酸分子雜交技術，具有敏感性高（可檢出10-9―10-12的核酸）和特異性強等優點。兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補的堿基序列，就能夠特異性的結合而成為分子雜交鏈。據此，可在已知的DNA或RN段上加上可識別的標記（如同位素標記、生物素標記等），使之成為探針，用以檢測未知樣品中是否具有與其相同的序列，并進一步判定其與已知序列的同源程度。
核酸探針技術已被廣泛應用于進出口動植物及其產品的檢驗。用于檢驗食品中一些常見的致病菌及產毒素菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原體的檢驗。近年來，放射性同位素標記的核酸探針正越來越多地用于產腸毒素性大腸桿菌的快速檢測。
2.5 多聚酶鏈反應技術
多聚酶鏈反應技術是一種極敏感的分子生物學方法，是一項DNA體外擴增技術，在體外對特定的雙鏈DN段進行高效擴增，故又稱基因體外擴增法。
多聚酶鏈反應技術快速、特異、敏感，在食品中致病菌的檢測方面具有很大的應用潛力。如可用于單核細胞增多癥李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、頑固性梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌等的檢測。
2.6 基因芯片技術
基因芯片技術能同時將大量探針固定于支持物上，可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術的操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足，是一種在生物技術產品檢測中極有發展前景和應用價值的技術，也是近年來國內外研究的熱點，基因芯片檢測技術完全可能成為21世紀最具活力的檢測技術之一。
基因芯片檢測技術可以判斷該植物是否含有外來的基因序列，而鑒定該植物是否為生物技術作物。
2.7 免疫傳感器
免疫傳感器是根據生物體內抗原-抗體特異性結合并導致化學變化而設計的生物傳感器，其主要由感受器、轉換器和放大器組成。免疫傳感器是多學科邊緣交叉的產物，其研究涉及到電化學、物理、生物、免疫學和計算機等領域的相關知識。
免疫傳感器主要有:酶免疫傳感器、電化學免疫傳感器(電位型、電流型、電導型、電容型)、光學免疫傳感器(標記型、非標記型)、壓電晶體免疫傳感器、表面等離子共振型免疫傳感器和免疫芯片等。
基于抗原-抗體特異性結合的工作原理，免役傳感器在食品檢測中的應用主要體現在對生物性危害的檢測。如可用于致病菌、生物毒素、農藥、獸藥等的檢測。
3.現代生物技術在食品檢驗中的應用進展
當今食品檢驗趨向于簡便、快捷、靈敏和微量化。現代生物技術以其自身的獨特優勢在食品檢驗中顯示出巨大的應用潛力，已引起分析化學家和生物學家的濃厚興趣，并已獲得廣泛的應用，前景廣闊。國外生物技術在食品檢驗中的應用研究已比較系統、完整、成熟，國內由于各種條件的限制，目前實際應用并不多。生物技術要在食品檢驗中取得更加廣泛的應用，仍需在價格、效能、方便、實用性和可靠性方面進行深入的研究。
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doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.03.039 文章編號：1004-7484（2014）-03-1235-02
宮頸癌的發病率在全球女性惡性腫瘤中排名第三（15%），但是在發展中國家卻居于第二位，[1]僅次于乳腺癌。據世界衛生組織統計，全球每年大約有530000名婦女被診斷為宮頸癌，每年約有75000名婦女死于這種疾病[2]。在宮頸癌患者中，高危型人瘤病毒（HR-HPV）感染是其發生的主要病因[3]。
1 資料與方法
1.1 一般材料 收集2013年1月至2013年6月在我院婦科門診進行就診的患者，進行TCT檢測者2658例，其中陽性患者257例，進行HPV檢測者1183例，其中陽性患者174例。所有標本按不同年齡分為6組。
1.2 儀器與試劑 凱普醫用核酸分子快速雜交儀與HPV核酸擴增分型檢測試劑盒均由凱普生物儀器有限公司生產。TIB-Autoprep 1000由泰普生物科學（中國）有限公司生產。
1.3 檢測方法
1.3.1 TCT檢測方法 首先用棉球擦去患者宮頸表面分泌物，然后用頸管刷插入子宮頸管內收集宮頸脫落細胞，標本取完后將宮頸刷放入裝有Thin prep（液基宮頸細胞學檢查）專用保存液的小瓶中攪拌、漂洗，蓋好瓶蓋送檢。標本經過TIB-Autoprep 1000處理儀處理，就可以得到一張薄而均勻的直徑為2cm大小的圓形細胞涂片，在顯微鏡下觀察宮頸細胞并進行細胞學分類診斷。
1.3.2 HPV檢測方法 同樣是先用棉球擦去患者宮頸表面分泌物，然后用專用的HPV特制毛刷收集宮頸脫落細胞，標本連同毛刷保存于HPV保存液中。采用雜交捕獲2代技術（HC2），即使用化學發光法的核酸雜交檢測方法，在體外進行核酸雜交，利用化學發光法，使微孔板信號擴增，對宮頸標本中的13種高危型人瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）DNA進行半定量檢測。可檢測的13種HPV亞型，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68，陽性閡值是HPV-DNA，1.0pg/ml。
2 結 果
2.1 TCT不同年齡組結果 見表1。共有2658例患者進行TCT檢測，其中陽性患者257例，占患者總數的9.7%。有表1可見，40-49歲年齡組陽性率最高（12.48%），20-29歲年齡組次之（9.48%），此后排序分別為50-59歲，30-39歲年齡組。
2.2 HPV不同年齡組結果 見表2。共有1183例患者進行HPV檢測，其中陽性患者174例，占患者總數14.7%。有表2可見，20-29歲年齡組陽性率最高（16.99%），40-49歲年齡組次之（15.20%），此后排序分別為50-59歲，30-39歲年齡組。
3 討 論
HPV是一組無包膜的雙鏈環狀DNA病毒，對皮膚及黏膜上皮具有特殊嗜性，目前發現和鑒定出200多種HPV亞型[4]，據誘發病變的良惡性不同，HPV又分為高危型和低危型。低危型HPV-6、11、42、43和44，常與生殖器尖銳濕疣和低程度鱗狀上皮病變的發生有關。高危型HPV-16、18、31、33和45常與中重度鱗狀上皮病變及惡性腫瘤的發生有關。
我國是宮頸癌的高發區，我國每年侵襲性宮頸癌的新發病例為45689例，死亡例數為25561例，占全球總數10%。本文所做統計TCT陽性率在40-49歲年齡組最高，為12.48%，20-29歲次之為9.48%。HPV陽性率在20-29歲年齡組達到最高，為16.99%，40-49歲年齡組次之為15.20%，其中LSIL以20-29歲年齡組陽性率最高為3.7%，HSIL以40-49歲年齡組陽性率最高為3.4%。與一些文獻報道有所差異，可能是由于地區性和環境的差異所致，有待進一步研究。
最主要原因，大量吸煙、避孕藥、及和生殖、社會經濟和衛生狀況等各種途徑均增高HPV感染概率，促使宮頸癌的產生。性活躍期婦女HPV感染十分常見，初次性活躍期的婦女中HPV感染率最高，約50-80%性活躍期婦女感染HPV，其中50%為高危型HPV感染。呼吁晚婚、少育，做好宮頸癌三級預防：一級預防（應用疫苗），將HPV扼殺在搖籃中，對青少年女性，提前應用疫苗；二級預防（宮頸篩查），建立健全防癌抗癌計劃，做好宮頸細胞篩查計劃；三級預防（檢查治療），發現有感染跡象女性，做好下一步治療，在早期，阻斷病變，做到早發現早治療，以預防、杜絕宮頸癌發生。
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基因擴增是分子生物學領域的常用研究手段，目前應用最廣的是常規PCR和real－timePCR技術［1］，因其靈敏度高，特異性強，已成為分子生物學領域的關鍵技術。但PCR方法的操作較復雜，對操作人員和儀器設備的要求都較高，不適合基層及現場的快速檢測。隨著分子生物學技術的不斷發展和改進，新技術不斷涌現，TsugunoriNotomi等［2］于2000年提出了LAMP，一種新穎的核酸擴增技術，利用該技術只需在恒溫條件下(60～65℃)保溫幾十分鐘就可快速完成核酸的擴增，無需購置昂貴的PCR儀，操作簡單，快速，可用于現場的快速檢測，近年來已得到廣泛的應用。本文綜述了LAMP技術的基本原理、相對于傳統核酸檢測技術的優點、產物的檢測方法及其臨床應用，最后指出LAMP目前存在的不足以及應采取的相應措施，并對其發展前景進行了展望，從而為LAMP技術在臨床研究上的應用提供參考。
1LAMP法的原理及特點
1.1LAMP引物的設計LAMP技術的核心之一在于引物的設計，因此，設計出特異性強的引物是進行LAMP實驗的首要任務。LAMP引物由一對內引物(FIP與BIP)和一對外引物(F3與B3)組成，其中FIP由F1c和F2組成，BIP由B1c和B2組成，嚴格針對靶基因3'端的F1c、F2c和F3c區以及5'端的B1、B2和B3區而設計［3］，結構組成如圖1所示。
1.2擴增原理DNA在65℃左右處于動態平衡狀態，此時，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈［4，5］。據此，LAMP反應被劃分為2個階段，即起始物合成階段和循環擴增階段。在第1階段，內引物FIP首先與模板F2c區結合，啟動互補鏈的合成，產生雙鏈DNA。接著，引物F3與F3c互補配對，在BstDNA聚合酶的作用下，啟動鏈置換反應，并釋放出由FIP引導合成的單鏈，此單鏈的5'末端存在互補序列(F1c和F1)，于是通過堿基互補配對形成一環狀結構。以此鏈為模板，與FIP和F3類似，在BIP和B3的作用下，在DN段的另外一端產生了新的環狀結構，于是整條鏈呈啞鈴狀結構［6］，如圖2所示，到此，第1階段反應完成。循環擴增階段，以啞鈴狀結構為模板，FIP與莖環區域F2c雜交，同時，F1c與F1結合，啟動新一輪鏈置換反應，解離出由F1引導合成的雙鏈核酸，并釋放由F2引導合成的單鏈，此單鏈兩端均成環狀結構，BIP與莖環區域B2c互補，啟動新一輪擴增。如此不斷循環，莖的長度和環的個數都不斷增加，最后的產物為莖－環狀DNA與花椰菜狀DNA所組成的混合物。
1.3LAMP技術的優點與普通PCR相比，LAMP具有許多優點:①特異性強，引物的設計須嚴格針對靶基因的6個區域，任何一個不匹配就會導致反應無法進行;②靈敏度高，可檢測出1～10拷貝的模板，比PCR高出10倍的檢測限［7］;③反應時間短，只需在恒溫條件下保溫30～60min就可完成擴增;④設備簡單，不需要昂貴的PCR儀和特殊的試劑，只需一臺恒溫設備就可進行;⑤產物易檢測，只需用肉眼觀察有無白色渾濁或有無綠色熒光，就可判斷擴增是否發生。LAMP與普通PCR的比較結果見表1。
1.4LAMP產物的檢測反應結束后，對結果進行判定常用瓊脂糖凝膠電泳檢測、濁度檢測、熒光比色檢測和熒光實時定量檢測
1.4.1濁度檢測隨著核酸的大量生成，溶液中會發生如下反應:(DNA)n－1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4－7與溶液中的鎂離子結合，生成肉眼可見的焦磷酸鎂白色沉淀，通過與陰性管比較反應液的渾濁情況，或用濁度儀檢測其在400nm處的沉淀濁度，就可判斷擴增的有無。
1.4.2熒光比色檢測對LAMP產物進行熒光比色檢測時，常用的染料有SYBRGreenⅠ、鈣黃綠素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等［8］。其中，SYBRGreenⅠ和HNB的檢測靈敏度最高，是鈣黃綠素的10倍［9］，然而SYBRGreenⅠ不能在反應前加入LAMP體系中，否則會抑制反應［10］，而反應后加就必須開蓋，又違反了LAMP不開蓋原則，造成氣溶膠污染。HNB則是在反應前加入體系中，避免了開蓋污染的問題，擴增結束后，陽性管呈紫色，陰性管呈天藍色，由此，可判斷靶基因的有無。
2LAMP技術的應用
LAMP技術自2000年開發以來，因其簡便快速，操作簡單等優點，已廣泛應用于細菌、病毒、寄生蟲和動物胚胎性別鑒定等檢測中。
2.1細菌的檢測YoshiteruAoi等［11］利用LAMP對環境中的氨氧化細菌進行了測定，結果可檢測出10個拷貝數的DNA，具有與real－timePCR相同的靈敏度，且背景DNA對LAMP的檢測干擾很小，可忽略不計。徐芊等［12］將LAMP用于檢測副溶血弧菌，直接對食品樣品進行檢測，只用一臺恒溫水槽，65℃反應1h，即完成擴增反應，與傳統培養方法相比，大大縮短了檢測周期，檢測限達到89cfu/g。葉宇鑫等［13］將原位熒光LAMP技術應用于食品中沙門氏菌的檢測，與傳統沙門氏菌檢測方法和PCR方法相比，原位熒光LAMP無需破碎細胞提DNA，反應方便易行，耗時少;恒溫條件(63℃)下反應，避免了原位PCR方法過高的循環溫度(95℃)對細胞結構的破壞;在檢測人工污染的樣品時，結果沒有受到雜質的影響，可以檢測到樣本中的單個細胞。張宏偉等［14］以莢膜脂多糖合成調控子resA為靶基因片段，設計了肺炎克雷伯菌特異性引物，建立了LAMP檢測方法，靈敏度可達2.2～3.4CFU/100g，檢測流程可縮短至2d，比PCR法更加快速。董培陪等［15］結合LAMP與橫向流動試紙條技術(Lateralflowdipstick，LFD)建立起一種鰻利斯頓氏菌快速檢測方法，能在30min內完成檢測，靈敏度為7.7cfu/ml，比常規PCR方法高一個數量級，通過與橫向流動試紙條檢測技術結合，進一步克服了由非特異性擴增導致的假陽性。可見，將LAMP技術用于細菌檢測時，其檢測限比常規PCR更高，與real－timePCR法相比則具有相同的靈敏度，無需分離培養細菌，可直接提取感染動物組織基因組進行擴增［16］，操作更為簡單、方便，且不需要昂貴的儀器，該方法有望成為細菌檢測的常規手段。
2.2病毒的檢測
2.2.1DNA病毒TingCai等［17］利用LAMP方法檢測血清樣本中的HBV，并與real－timePCR法進行了比較，結果表明兩者的檢出率一致，且對于低濃度的樣品，LAMP的準確率更高，更適用于臨床檢測。李明云等［18］根據對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的結構蛋白VP26基因序列，設計一套引物，建立了針對WSSV的LAMP檢測方法，可檢測到最低模板濃度為0.563pg/μl，靈敏度比常規PCR法高1個數量級，并且當模板濃度由10－5倍稀釋到10－6倍時，PCR產物濃度顯著降低，受模板濃度的影響較大，而LAMP的擴增產物濃度則基本不受影響。張侃等［19］將LAMP用于偽狂犬病病毒的檢測，在45min內完成檢測，其特異性與PCR方法一致，敏感性則是PCR的100倍，最低能夠檢測10個拷貝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL．M．Poon等［20］于2004年首先建立了針對SARS的RT－LAMP技術，通過對31例SARS患者的檢測，檢出率為64%，其靈敏度略低于實時PCR，但是比常規PCR法更高。TetsuoYoneyama等［21］用RT－LAMP法檢測了糞便中的HAV，實驗中加入了環引物，將檢測時間縮短至50min，與RT－PCR法(需要2～3h)相比大大節省了時間;對HAV實驗室病毒毒株的檢測，靈敏度為0.4～0.8FFU/5μl，與侵染性實驗法相當，且能檢測到HAVⅢ型，比real－timeRT－PCR法的檢測范圍更廣，可作為基層疫情監控的常規檢測方法。聶凱等［22］采用一步法的RT－LAMP檢測人甲型H1N1流感病毒基因，在反應體系中直接加入反轉錄酶，大大簡化了LAMP技術用于RNA病毒檢測的操作步驟。此外，LAMP技術在檢測艾滋病病毒［23］、鵝細小病毒［24］、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒［25］、人星狀病毒［26］、單純皰疹病毒Ⅰ型［27］、豬圓環2型病毒［28］等方面均有報道，無論是DNA還是RNA病毒LAMP都能做到快速檢測，在檢測RNA病毒時更是省去了RT－PCR法中費時的反轉錄步驟，在臨床檢測上顯示出越來越重要的地位。
2.3寄生蟲的檢測HiromiIkadai等［29］將LAMP法用于巴貝斯蟲的檢測，證實LAMP具有與PCR和光學顯微鏡同樣的敏感性，而且更加簡便，快速。李群等［30］為提高牛巴貝斯焦蟲病的檢出率，采用LAMP法進行了檢測，結果表明，LAMP檢測體系特異性強，與雙芽巴貝斯焦蟲DNA不發生交叉反應;敏感性高，最小檢測值為0.014fg，為一般PCR法的103倍。Jun－HuChen等［31］用LAMP法對間日瘧感染患者進行診斷，在117例鏡檢呈陽性的血清樣本中，LAMP檢出115例，靈敏度和特異性與鏡檢法和nestedPCR法相近，但是操作更加簡單，不需要昂貴的儀器，且對DNA的抽提要求不高，有望成為檢驗科或瘧疾診所的常規診斷方法。
2.4動物胚胎性別的鑒定LAMP在動物胚胎性別的鑒定方面也有應用，HirokiHirayama等［32］首次利用LAMP法檢測牛胚胎的性別，鑒定的準確率為88.9%～94.4%，整個鑒定過程不超過1h。KhairyM．A．Zoheir等［33］也成功將LAMP用于牛胚胎性別的鑒定，以EB和CuSO4為指示劑，反應45min即可通過肉眼觀察顏色的變化，從而鑒定出雌雄，準確率達100%，簡單快速，成本低，可用于養殖場現場操作。
3不足與對策
3.1存在的不足對擴增產物定量檢測時，需要購置昂貴的熒光定量PCR儀或濁度儀;LAMP法的擴增靶序列長度控制在300bp以下，對引物要求高，由在線軟件設計的引物有上千條，要篩選出合適的引物需要耗費大量的工作;LAMP靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染;傳統PCR產物的電泳圖都是呈現單帶，而LAMP法陽性反應則是呈階梯狀條帶，因此，若有非特異性擴增的產生，則不易辨別，造成LAMP容易出現假陽性。
3.2對策嚴格做好防污染工作，體系的配制一定要在超凈臺內進行，實驗器材要進行消毒滅菌;BstDNA酶最后加入體系，若有必要可以在體系上覆蓋一層礦物油;LAMP體系的配制和檢測必須要嚴格分區，操作人員往返兩區域進行實驗時要更換實驗服，同時要盡可能地避免無關緊要的人員流動，凡進入檢測區的實驗器材都不要再拿回配制區。由于開蓋檢測容易造成氣溶膠污染，所以反應結束后最好不要打開PCR管，可采用反應前加入HNB染料的方法對擴增產物進行定性檢測。一旦出現污染，應立即停止實驗，每天給實驗室通風，給超凈臺紫外滅菌并通風，一段時間后更換所有試劑再做。采用HidenoriTani等［34，35］提出的ABC－LAMP技術對LAMP產物進行定量，該方法主要是在反應體系中加入探針AB－QProbe和已知濃度的內標，探針的熒光值代表靶基因與內標的比值，隨著反應的進行，靶基因與內標被同等程度擴增，通過測定反應終點兩者的熒光值之比，結合內標的初始濃度就能對初始模板定量，從而實現了以較低的成本對產物的定量檢測。
1引言
特定序列單鏈核酸（DNA）的特異性檢測在臨床診斷、基因治療、環境調查、食品安全及生物醫學研究等領域都具有十分重要的意義＼[1～5＼]。分子信標（Molecular beacons）是一種呈發夾結構的莖環雙標記的寡核苷酸探針，具有操作簡單、選擇性好以及不必與未反應的探針分離即可實時檢測等特點，在特定序列單鏈DNA的檢測中扮演著越來越重要的角色＼[6～13＼]。近年來，有關分子信標對特定序列單鏈DNA檢測的報道逐漸增多＼[14～16＼]。盡管分子信標在DNA的定性及定量分析中顯示出廣闊的應用前景，但經典分子信標在實際定量分析中還存在一些不足： （1） 經典分子信標具有較強的背景信號，影響定量檢測的檢出限＼[17＼]；（2） 相對于核酸染料而言，分子信標對核酸檢測的靈敏度較低；（3） 經典分子信標需要在兩端分別標記熒光基團及猝滅基團，制備時間長且成本高。
核酸染料Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，具有很高的靈敏度＼[18，19＼]。它在水溶液中熒光很弱，與單鏈DNA幾乎不發生作用，但與雙鏈DNA具有很強的親和性，能嵌入雙鏈DNA的小溝中，與雙鏈中的A/T堿基對發生特異性結合，使其結構發生變化，導致熒光強度大大增加＼[20，21＼]。根據此原理，Hoechst 33258在雙鏈 DNA 含量測定中，已得到廣泛應用＼[22，23＼]。
Hoechst 33258 與分子信標聯合應用的報道較少。James等＼[24＼]利用Hoechst 33258 與分子信標研究了發夾聚酰胺對雙鏈DNA的解鏈溫度的影響，并獲得了較好的結果。到目前為止，利用Hoechst 33258 結合分子信標對特定序列核酸的檢測還未見報道。
本研究利用無標記的分子信標（無有機熒光基團和熒滅基團）及Hoechst 33258建立一種高靈敏、高選擇性的特定序列核酸檢測方法。在這種分析方法中，將無標記分子信標的莖完全設計成C/G堿基對，分子信標的環設計為目標DNA的互補序列。利用分子信標與目標DNA反應之前，Hoechst 33258熒光信號很弱，而與目標DNA反應之后，其熒光信號顯著增強的基本原理，實現對特定序列DNA的定量檢測。
相對于經典分子信標對核酸的檢測而言，本方法具有以下特點：（1）使用無標記分子信標，省去了標記步驟， 降低了分析成本； （2）將分子信標的莖完全設計成C/G堿基對，而Hoechst 33258不與C/G堿基對發生作用，因此背景熒光很低，可顯著降低分析方法的檢出限； （3）利用Hoechst 33258的熒光代替經典分子信標中的熒光基團對目標核酸進行檢測，可顯著提高檢測的靈敏度。這主要是因為利用核酸染料檢測核酸時，一個核酸分子能與多個核酸染料相結合，而每個分子信標只有一個熒光基團。同時無標記的分子信標又保留了經典分子信標中莖環的結構，仍然具有很高的選擇性。
3結果與討論
3.1檢測原理
利用無標記的分子信標及Hoechst 33258對特定序列核酸檢測的原理如圖1所示。在沒有目標DNA時，盡管分子信標處于莖環結構狀態，但分子信標的莖全部由C/G堿基對組成，不與Hoechst 33258作用，此時Hoechst 33258的熒光信號很弱；在有目標DNA時，其與分子信標發生雜交反應，形成雙鏈DNA后再與Hoechst 33258結合，Hoechst 33258的熒光強度顯著增強。根據熒光增強的程度，實現對特定單鏈DNA的檢測。
3.3.6核酸染料Hoechst 33258與雙鏈DNA作用的時間的影響核酸染料Hoechst 33258只有與雙鏈DNA結合之后才會發出較強的熒光，因此它與雙鏈DNA的結合時間是影響其熒光強度的重要因素。本實驗對Hoechst 33258與雙鏈DNA的結合時間進行了考察。結果表明，在9 min內，Hoechst 33258的熒光強度隨著時間的增加而增大；當結合時間超過9 min后，Hoechst 33258的熒光強度不再發生變化。
3.4工作曲線及復雜樣品中核酸的檢測
在3.5堿基錯配分析
對不同堿基錯配序列DNA進行了分析，以考察方法的特異性，結果如圖4所示。對于不同堿基錯配序列的DNA，Hoechst 33258的熒光強度具有顯著區別。對于目標DNA序列、單堿基錯配DNA序列、雙堿基錯配DNA序列及三堿基錯配DNA序列，所對應的熒光強度之比
4結論
利用無標記的分子信標與單鏈DNA特異性反應生成雙鏈，再與Hoechst 33258結合后，其熒光顯著增強的基本原理，建立了檢測特定序列核酸的新方法。本方法操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、重現性好、檢出限低。
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AbstractA highly sensitive and selective method for specific DNA sequence detection is developed using a nonlabeled molecular beacon （MB） and a nucleic acid dye Hoechst 33258. It is demonstrated by a specific DNA sequence of wildtype HBV as a model system. In this strategy， the stem of MB is completely designed as C/G base pairs. In the absence of target DNA， the interaction between Hoechst 33258 and the MBs is very weak，and the fluorescence signals of Hoechst 33258 is very low. In the presence of target DNA， the MBs hybridize with the target DNA and form doublestranded structure. Hoechst 33258 binds to dsDNA， and the fluorescence intensity is significantly enhanced. Under the optimum conditions， the fluorescence intensity of Hoechst 33258 exhibits good linear dependence on target DNA concentration in the range of 2×10
關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；抗體檢測；病原檢測
中圖分類號：S858.28 文獻標識碼： 文章編號：1007-273X（2016）12-0009-02
豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴重危害養豬業的傳染病。以妊娠母豬流產、死產、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡階段豬的呼吸道癥狀為特征[1-3]。該病毒具有抗原變異性、嗜巨噬細胞性、持續感染性及抗體依賴增強性作用，臨床上常與其他病原混合感染使臨床表現形式復雜化[4-5]。要確診需要進行實驗室檢測，實驗室檢測方法很多，每種方法在檢測的特異性、敏感性、成本等方面存在差異。因此，建立有效且適合基層使用的PRRS檢測方法是防控PRRS的重要環節，本文就PRRS檢測方法進行了綜述，供參考。
1 抗體的檢測
免疫熒光抗體（IFA）試驗、免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）、血清中和（SVN）試驗及酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等都可用于檢測PRRSV的特異性抗體，通過檢測抗體水平可以對豬個體或整個豬群的PRRSV感染狀況或疫苗免疫效果給予一定的評價。
1.1 PRRSV抗體檢出時間及維持時間
當豬感染PRRSV 7～14 d后，機體首先產生IgG抗體，機體產生的抗體隨著時間的積累呈增加的趨勢，當抗體達到峰值后在體內維持一段r間，然后抗體水平逐漸下降，不同檢測方法檢測出的抗體出現峰值時間、峰值維持時間以及抗體在體內存留時間均不一致。在試驗感染條件下，通過IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分別在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d內檢測到抗體。PRRSV特異性IgM抗體在接種后5 d可以檢測到，并可持續21～28 d。不同的方法檢測出的抗體峰值時間各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，隨后抗體滴度逐漸下降。感染PRRSV后用各種方法檢測的抗體消失時間為： IFA 4～5個月、ELISA 4～10個月以上、IPMA 11～12個月、SVN12個月[6-8]。疫苗免疫后各種方法的檢測結果與上述時間段基本一致。
1.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
ELISA適于大規模檢測，方便、易行，操作過程及結果判斷能夠標準化，且具有高度的特異性和敏感性，以間接ELISA和阻斷ELISA常見[6-8]。利用ELISA檢測血清中PRRSV抗體出現的時間與用IPMA和IFA檢測抗體出現時間基本相同，但是血清中PRRSV抗體持續時間明顯長于IPMA和IFA所檢測出的抗體維持時間，檢出時間長達1年左右。
ELISA診斷抗原有2種，一種是從細胞培養物中純化的全病毒抗原，另一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。無論是用全病毒還是用基因表達產物作為診斷抗原建立的ELISA，均具有較強的背景反應。IDEXX公司生產的PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒在全球范圍內推廣使用，曾被認為是PRRSV抗體檢測的金標準。但不久通過對照試驗對該試劑盒檢測效果進行評價，發現IDEXX試劑盒存在假陽性結果，PRRSV全病毒抗原間接ELISA與IDEXX HerdChek ELISA試劑盒相比，前者特異性僅為26.6%，敏感性也僅為48.8%。如果該方法應用于實際生產中，將會對PRRS的凈化以及后備種豬的篩選帶來嚴重后果。因此，在ELISA試劑盒研制上還需要廣大從事ELISA試劑盒研制的人員做出更大的努力來彌補現有試劑盒的不足之處，進一步完善中國ELISA診斷試劑盒標準[8-10]。
1.3 免疫過氧化酶單層細胞試驗（IPMA）
IPMA是廣泛用于該病診斷的一種方法，其敏感性和特異性都較好，可用于PRRSV的血清抗體檢測、病毒鑒定及抗原檢測。自1991年建立至今，仍是歐洲和美洲國家廣泛使用的血清學診斷方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA試劑盒檢測抗體，并進行比較，發現利用同源性抗原檢測抗體，IPMA比ELISA試劑盒檢測出抗體的時間提前2～3 d，特別是對母源抗體的靈敏度更高，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更適合用來診斷PRRSV。由于IPMA結果判定具有一定主觀性，不能自動顯示，同時費時，檢測費用高，不適合大規模檢測，因此在實際生產中未得到廣泛應用[9，10]。
1.4 免疫熒光抗體（IFA）試驗
IFA法在美國被廣泛利用，該法需進行細胞培養、熒光鏡檢，結果借助肉眼來觀察，因實驗室操作方法的不同、技術人員的不同和非特異性熒光等原因產生較大的主觀性。對IFA和ELISA方法進行比較，結果發現二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗體的水平太低。ELISA可以檢測抗體滴度比較低的血清，而用IFA則檢測不到，由此造成假陰性結果。
利用間接熒光抗體試驗對試驗感染PRRSV的豬的抗體進行檢測，結果表明，在感染病毒后9～14 d，首先檢測出IgG抗體，高滴度的IgG抗體可以維持7周；感染病毒后35 d再次接種PRRSV，體內IgG抗體滴度不發生變化，病毒血癥仍可檢測到。在接種5～28 d可以檢測到IgM抗體，35 d后再次接種病毒其抗體在短時間內增加。利用熒光抗體試驗在不同時間對IgM抗體水平進行檢測，在短時間內有助于鑒別是否感染PRRSV。因此，在實際生產過程中要盡可能避免假陰性結果的出現，在條件允許情況下結合其他檢測結果得出結論[9-11]。
血清中和試驗與IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特異的中和抗體出現比較晚，要在感染后30～60 d才能檢測到。對于急性感染的敏感性更差，與其他檢測方法的結果符合率低，達不到早期診斷的目的。因此，該方法不適合應用于實際生產中，僅限于實驗室診斷[10-12]。
血清學呈陽性的結果并不能確定PRRSV是否能引起臨床發病，也不能區別是感染野毒還是疫苗毒，也不能說明動物機體是否為病毒的攜帶者，僅能說明曾經感染過PRRSV。對于血清學陰性可能是未感染PRRSV或感染但還未產生抗體，或以前感染過但現在血清轉陰，或是檢測方法的敏感性不夠或操作誤差。因此，現有的血清學方法不適合監測整個豬群的群體情況，其僅能對單個個體作出初步診斷，要作出更準確的診斷，還應與免疫狀況或病毒分離或抗原的檢測相結合，才能達到對PRRS診斷、疫情凈化的目的[10-12]。
2 病原的檢測
病原的檢測主要包括免疫學檢測以及生物學檢測，其中免疫學檢測包括免疫熒光染色法、免疫過氧化物酶染色法以及免疫膠體金技術等，而生物學檢測主要進行病毒的分離；核酸的檢測主要利用分子生物學技術對病毒特定的基因組進行檢測。由于免疫學檢測存在較大的弊端，下面僅對生物學檢測以及核酸檢測技術作一簡單的概述。
2.1 生物學檢測―病毒的分離
用于PRRSV分離的細胞有原代豬肺巨噬細胞（PAM）、傳代細胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因為傳代細胞系對該病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬細胞對病毒的易感性都相同，所以在用PAM進行分離病毒前，還要進行批次試驗，只有當特定滴度的標準病毒在新的巨噬細胞中生長良好時，方可使用，該方法是診斷PRRSV感染的經典方法，多用于急性病例的確診和新疫區的確定，但是也存在不足之處，如費用較高、勞動強度較大，耗時多，且有可能污染其他病毒等，因此該方法不利于大規模豬場疫病的檢測[10-12]。
2.2 核酸檢測（反轉錄-聚合酶鏈式反應）
核酸檢測（反轉錄-聚合酶鏈式反應）反轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）V泛應用于PRRSV的鑒定及臨床診斷，并在方法上不斷改進和提高，擴增的目的片段也主要是針對PRRSV的核衣殼蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因組中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和區別于歐洲型的特異性決定簇。RT-PCR比病毒分離更省時、省力，敏感性和特異性更強。用于RT-PCR檢測的樣品包括血清、及肺臟、脾臟等組織[13-15]。
利用RT-PCR對試驗感染豬進行抗原和抗體檢測，并與病毒分離和ELISA抗體檢測結果進行了比較，結果發現該方法可以在感染24 h后檢測到病毒的核酸，但不能分離到病毒，而抗體只能在感染后第9d檢測到，由此可見RT-PCR的靈敏度明顯高于病毒分離和ELISA，有利于早期診斷[13-15]。
PCR方法可以區分歐洲株與美洲株，但其臨床應用意義并不大。國外應用PCR診斷PRRSV已取得很大進展，許多學者根據PRRSV不同的ORF序列，設計了不同引物，建立了檢測PRRSV核酸的RT-PCR方法。隨著RT-PCR技術的發展，也陸續出現了熒光標記的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信標RT-PCR方法檢測臨床樣品，這些方法比常規RT-PCR方法的特異性更強，敏感性更高，但需要更高的成本。應特別注意的是，因其敏感性特別高，易引起假陽性，因此在檢測時應盡可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的診斷及監測中發揮很大作用，在ELISA檢測為陽性的基礎上，再用高敏感性的RT-PCR進行確診，這不僅可以降低費用，而且可拓寬RT-PCR的應用前景，如后備種豬的篩選，持續性感染豬的診斷及豬群的凈化等[13-15]。
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1診斷方法
1．1形態學診斷AP感染人和易感動物后，主要侵染成熟或未成熟的髓系白細胞。取可疑患者末梢血作厚、薄血涂片，經吉姆薩染色，于中性粒細胞胞漿內發現多個無形體緊密堆積在一起形成桑葚樣包涵體(morulaeelementarybody)可支持診斷。形態學診斷方法對采血時間要求嚴格，且診斷者要有較豐富的看片經驗，否則容易發生漏診和誤診。
1．2血清學診斷通過檢測患者血清中抗AP的IgM和IgG類抗體水平及升高程度，可特異性診斷HGA。常用方法為間接免疫熒光(immunofluorescenceassays，IFA)法。采集急性期(發熱初期，一般發病1周內)與恢復期(至少間隔2～3周)雙份血清。如恢復期血清抗體檢測陰性，應建議醫生采集第3份血液樣本(間隔2～4周)。如果同時檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結果強烈支持AP感染。如果急性期抗體升高，而恢復期沒有升高或輕微升高，則應采集第3份血液樣本(間隔2～4周)進行進一步檢測。血清學診斷方法準確，特異性高，但由于抗體出現較晚，診斷所需時間較長，故血清學檢測無法在早期對HGA進行診斷［3］。
1．3分離培養病原體多用人白血病細胞系HL60進行AP的分離培養。最常用的分離方法是將白細胞部分接種培養基，然后將100～500μL抗凝血接種到2×105或1×106個懸浮細胞內，每2～3d染色檢查包涵體，一般5～10d可查見包涵體。從患者血標本中分離AP是確診該病最可靠的方法，但細胞培養分離AP方法復雜和耗時，而且成功率不高。最終確認依然需要檢測AP特異性核酸。
1．4分子檢測方法AP感染可通過檢測AP的DNA進行診斷，AP的分子生物檢測方法可用于感染急性期的診斷，或用于后期病原體培養物的鑒定。分子檢測診斷方法具有較高敏感性、特異性和可重復性，而且診斷快速、操作簡單。
2AP分子檢測技術
AP分子檢測技術可用于對可疑患者血清樣本進行檢測，亦可對細胞培養后血細胞標本進行檢測，同時也用于AP傳播媒介－蜱的基因分子檢測和分類。AP的基因組由單股環狀染色體構成，長度為1471282bp，G+C百分比為41．6%，含有1369個開放讀碼框(ORF)。其特征性基因為外膜蛋白(majorsurfaceprotein，msp)以及ankA基因，100%的菌株具有msp2基因，70%的菌株具有ankA基因。目前AP分子檢測常用的目標包括編碼16SrRNA、熱激蛋白(heat-shockprotein，groESL)、msp蛋白、AnkA蛋白等的基因。16SrRNA高度保守，是PCR檢測最常擴增的靶基因，熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應用廣泛，但groESL基因在不同種屬間具有較大的變異性，因此，對于診斷及菌株的鑒定有重要意義;msp編碼AP特征性外膜蛋白，這種蛋白質主要介導AP與不同宿主細胞間相互作用，并保證AP能更快地進入宿主細胞內。由于AP的宿主范圍很廣，包括多種脊椎動物和非脊椎動物，所以msp在不同來源的AP之間差異性大。其中msp2作為AP主要特征性外膜蛋白，已作為診斷AP感染的指征;ankA編碼的錨定蛋白能夠介導蛋白與蛋白之間的作用，因此AnkA在不同宿主間表現出多樣性［5］。目前ank基因鑒定通常用于msp2陽性病例基礎上，進行種屬分型［6］。AP感染的分子生物學診斷方法主要包括巢式PCR(nestedPCR)、實時定量熒光PCR(realtimePCR)和環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等。PCR和PCR相關檢測技術是診斷AP感染的常規方法，目標基因與PCR引物見表1。
2．1巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物(因其在第一次PCR擴增片段的內部)結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增產物。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異性，通常采用屬特異和種特異引物同時進行檢測。PCR檢測應分區進行，避免污染。16SrRNA高度保守，是巢式PCR檢測AP最常擴增的靶基因。由于AP的地域分布范圍廣，且有高度的生物學和臨床學多樣性，在比較不同地域發現的AP時最常用的方法就是巢式PCR。例如在波羅地海與挪威發現的AP比較研究就是用巢式PCR對16SrRNA和msp4進行測序分析［16］。Wuri-tu等用巢式PCR比較日本發現的AP與美國和歐洲AP的P44/msp2基因結構。熱激蛋白基因groESL擴增雖不如16SrRNA應用廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。Adrian等［17］通過巢式PCR鑒定和比對不同國家野生動物體內AP的groEL不同，鑒定出新的菌株。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因有重要意義。Massung等［18］在對ank基因鑒定并對AP進行種屬分型時也應用該種方法。
2．2實時定量熒光PCR(realtimePCR)實時定量熒光PCR是將熒光共振能量傳遞現象、光學技術與常規PCR結合的一種PCR檢測技術。即在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，在PCR指數擴增期間通過連續檢測熒光信號的強弱來實時測定特異性產物的量，從而實現核酸的精確定量，最后通過標準曲線對目的基因的初始量進行總量分析。由于實時熒光定量PCR儀自動化程度高，因此比常規PCR特異性更強且有效解決了常規PCR的污染問題。常用方法有SYBRgreen法和探針法(TaqManprobe)。Klaus-Peter等［10］將熒光染料摻入法(SYBRgreen)用于AP的抗生素藥物敏感性研究中。Joshua等［14］的研究中用探針法來鑒定AP和伯氏疏螺旋體。
2．3環介導等溫擴增技術(LAMP)環介導等溫擴增技術(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種2000年開始出現的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術。其特點是針對靶基因的至少6個區域設計至少4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下，60～65℃恒溫擴增，15～60min即可實現109～1010倍的核酸擴增，具有靈敏度高、操作簡單、反應時間短、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現白色。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由于LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，操作簡單方便。Lei等［15］用LAMP共針對目標基因8個區域設計6種特異性引物，特異性達100%。相比傳統PCR技術，LAMP的特點更適合HGA在農村用于早期診斷，有著廣泛的應用前景。
3小結與展望
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的一種重要的世界性傳染病[1]，這種病毒主要經由血液傳播，也可能存在其他傳播途徑如母嬰傳播、性傳播和家庭內接觸傳播。約有近半數的HCV感染傳播途徑不明確。丙型肝炎的流行呈全球性，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因。根據WHO統計，全球HCV的感染率約為3％，估計約2億人感染了HCV，每年新發丙型肝炎病例約有3.5萬例。目前尚無治療丙型肝炎的疫苗，也沒有有效的治療方法。因此防控丙型肝炎傳染源及阻斷傳播途徑最為有效的手段就是早期準確診斷并及時發現 HCV感染者。從傳染源和傳播途徑兩方面控制丙型肝炎[2]。正因為如此世界各國都在不遺余力地研究診斷丙型肝炎的新技術。自1989年建立了丙肝病毒抗-HCV檢測方法以來，隨著醫學檢測技術和儀器的不斷發展，丙型肝炎的檢測技術一直處于不斷發展中。到目前為止，丙型肝炎檢測技術主要有抗-HCV檢測、HCV-RNA核酸擴增檢測、HCV核心抗原的檢測以及同時檢測抗-HCV和HCV核心抗原4種類型。本文將對丙型肝炎臨床檢驗技術的發展與展望做一綜述，現報道如下。
1 抗-HCV的檢測
最早出現的HCV檢測技術是抗-HCV的檢測。由于HCV在病人外周血液中的含量及病毒抗原的含量很低，這就使得用常規方法難以直接檢測，經過十幾年的不斷改進和發展，其檢測方法又演變出多種，如:雙抗原夾心 ELISA、間接酶聯免疫吸附實驗(間接 ELISA)、重組免疫印跡法(RIBA)、蛋白芯片檢測法以及免疫層析法。在這些方法之中，重組免疫印跡法 (RIBA)是抗體檢測的金標準，蛋白芯片檢測法主要用于抗-HCV的分型。而ELISA由于其操作簡單，檢測設備廉價，因此成為應用最廣的抗體檢測技術。
根據出現時間的先后以及使用抗原的不同，抗-HCV檢測技術可分成三代。第一代抗-HCV IgG試劑盒所用的抗原來自病毒基因組非結構區 (C100)，它的使用使 HCV的輸血感染率下降了80%以上。但其缺陷是:靈敏度較低，抗體檢出時間較晚， 敏感性也較高，達到80％～90％，但假陽性較高。第二代試劑除了包被C100抗原外又加入了HCV核心區多肽C22—3和非結構區抗原C33C。抗-C22-3和抗-C33C感染后出現較早，敏感性和特異性明顯提高，感染后8～12周即可檢測。且對 HCV的特異性較好，二者聯合應用可進一步提高檢出率。第三代HCV抗體ELISA試劑中采用了重組的NSS多肽，核心區抗原比例相對下降，而相應地增加了非結構區的NSS區 C33C抗原的比例，添加了NSS區抗原使其敏感性和特異性得到進一步改善。
上述三代抗-HCV檢測方法多采用間接 ELISA，雖然也有過雙抗原夾心直接檢測抗-HCV的報道[3]，但由于HCV抗原存在不穩定性，因此至今仍無商品化的試劑盒。目前我國市售的抗- HCV試劑盒普遍是采用間接法的第三代抗-HCV ELISA試劑盒和膠體金試劑盒，其特異性可以達到92%～100%。但由于各廠家使用的HCV基因重組抗原的質量和各抗原片段包被比例有所不同，從而使各廠家試劑的靈敏度和特異性存在一定的差異，導致抗一HCV檢測結果的不一致，產生漏檢和假陽性等[4]，未能解決在正常ALT者和健康獻血者存在的假陽性問題。加上少部分免疫功能不正常的HCV感染者，則不能檢出抗一HCV。另外，由于“窗口期”的存在，仍有一定的漏檢率[5]。目前抗-HCV的檢測方法仍有改進的潛力，隨著對HCV的研究不斷深入，更多的 HCV蛋白會被發現，其中新型核心蛋白和外膜蛋白被認為能有效提高抗-HCV的靈敏度，但其對抗體的檢出率依賴于抗原的獲得方法，可能與抗原的構象表位有關[6，7]。
2 HCV-RNA核酸擴增檢測技術(Nucleic-acid Amplification Technology NAT)
從外周血中檢出HCV RNA是HCV復制活躍的可靠指標，在感染2個星期內的血清中可檢測到HCVRNA，在感染自然恢復前血清中 HCVRNA將達到一個高峰[8]， 目前NAT檢測被國內外部分機構作為 HCV感染的確認方法。但HCV RNA在達到峰值或重新出現前數天或數周內偶爾也可能檢測不到[9]。同時HCV RNA還受進食的影響，易與血中脂質及脂蛋白結合，降低檢出率[10]。因此在一定程度上影響了NAT檢測方法的完美。另外由于NAT檢測技術本身在技術和設備上要求較高，且耗時、實驗步驟較多(其中任何步驟出現問題均影響其檢出)，因此該方法也容易因污染而出現假陽性，難以在常規工作或基層實驗室推廣，限制了其應用的普遍性。
NAT檢測技術同為檢測HCV RNA，但不同的廠商發展出不同的方法和技術，其中PCR技術發展得最為迅速，也得到了最廣泛的應用，最早的是 RT-PCR，然后是套式PCR，現在是實時熒光定量PCR，檢測靈敏度特異性不斷提高，且實現了全自動定量檢測。最新的NAT研究有環介導等溫基因擴增技術(LAMP)以及基因芯片技術[11，12]，由于LAMP技術操作簡單，且無需特殊儀器，具有廣闊的應用前景。
3 HCV抗原的檢測
目前報道有兩類HCV抗原包括非結構抗原和核心抗原的檢測可作為HCV感染的指標。血清中HCV抗原的檢測有利于 HCV感染患者的早期發現，特別是某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者和某些不產生抗體的攜帶者。HCV核心抗原與 HCV RNA的動力學變化密切相關，可以作為HCV復制的標志[13]。
近年來對HCV抗原的檢測方法的研究不斷取得進展，關鍵點在于單克隆抗體的研制以及抗原抗體復合物解離劑的研究。近期美國Ortho公司已推出了用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒，與 RT-PCR方法相比，具有操作簡單、耗時短、對實驗環境要求較低以及假陽性率低等特點，在臨床上可用于HCV血清學轉換前的早期急性丙型肝炎診斷、抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析等[14]。HCV核心抗原存在的時間較短(約27～70d)，所以HCV核心抗原的檢測還要結合抗-HCV的結果。同時HCV核心區基因的變異也可能影響了HCV核心抗原的檢測，比如HCV核心區49位氨基酸的突變就降低了抗原測定的敏感性[15]。改進現行試劑盒的主要途徑是提高單克隆抗體對于天然抗原的構象表位的親和力。
對于非結構蛋白的檢測主要為NS3、NS4和NS5位點的蛋白[16]，由于這部分蛋白出現變異的概率較大，目前僅見報道。
4 同時檢測抗-HCV和HCV核心抗原
聯合檢測抗原抗體的思路是HCV篩查試劑盒和血清學檢測的發展方向。目前主要把HCV核心抗原和外周蛋白抗體及部分核心抗體相結合的檢測試劑盒[17]。HCV核心抗原是HCV感染者體內出現的早期感染指標，幾乎與HCV RNA同時出現，核心抗原和HCV RNA的動力學變化密切相關。
HCV核心抗原檢測用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中的HCV核心抗原。該方法不受被檢測樣品中抗-HCV的干擾，檢測結果準確可靠。可用于HCV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析[18]。目前已有兩家商品化的試劑盒面世，但是這兩種試劑盒都使用兩步檢測，而且檢測時間都較長（超過2h），不利于快速的篩查和POCT工作。另外這兩種試劑盒都不能區分陽性樣本中抗原和抗體的存在情況，不利于進一步分析病情。
綜上所述，無論HCV檢測技術的怎么發展，都必須秉著快速、準確和有效這些原則。由此可以預測未來HCV檢測技術會朝著兩個方向發展，一方面是要求技術上的快速、精確反應 HCV感染狀況的檢測，降低假陽性的概率，使人們盡早發現病情。另一方面是有助于治療HCV和療效觀察的檢測，不斷優化治療HCV的方法，爭取早日研究出治療HCV的疫苗。對于第一種方向，人們較為容易理解，因為隨著實驗技術的不斷進步，HCV檢測的靈敏度逐步提高，HCV感染的“窗口期”將不斷縮短。第二種方向也是當前分子診斷領域的方向，人們可以通過新的檢測方法或是幾種 HCV檢測方法的綜合應用來判斷病人的病情，從而給予臨床治療提供及時幫助和指導。
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關鍵詞：羊奶；牛奶；豆漿；多重實時熒光定量PCR
中圖分類號：S879.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0118-06
由于羊奶中含有的維生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結構成分與母乳基本相同，被營養學界稱之為“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人體過敏的異性蛋白，尤其適合胃腸較弱、體質較差的嬰幼兒飲用，但市場上的羊奶品質參差不齊。隨著消費者認可度的不斷提高，在利益的驅動下，在羊奶中摻入牛奶或者豆漿的現象非常普遍，摻假手段多種多樣，不斷變換，僅靠感官鑒評和傳統的試驗方法已不能滿足市場需要[2]，嚴重影響我國奶業的健康發展。
目前，用于檢測羊奶摻假的方法主要有氣象色譜、液相色譜、電泳、PCR、ELISA和近紅外光譜法等[3～6]。實時熒光定量PCR方法是以DNA為基礎的一種檢測技術，不受摻假形式的影響，可以進行快速、批量、自動、實時檢測分析，具有靈敏度高、準確性好等優點，已經在動物源性成分檢測項目上逐步取代一般PCR方法成為最常用的分子生物學檢測手段[7]。為了保障羊乳及其產品品質，確保消費者的利益，建立準確檢測牛羊乳及豆漿混摻的技術越來越重要。本試驗旨在利用TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，建立一種快速、準確檢測羊奶中是否摻有牛奶和豆漿的方法。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1試驗材料試驗所用標準液態牛奶、液態羊奶取自山東省畜牧研究所奶牛及山羊養殖基地，液態豆漿是本實驗室用大豆加工而成。市售樣品為購自濟南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。
1.1.2主要試劑與儀器試劑：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量檢測試劑盒（TaKaRa，日本）。
儀器：ABI7500實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）、高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）、Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀（Eppendorf，德國）。
1.2試驗方法
1.2.1樣品基因組DNA的提取分別取牛奶、羊奶、豆漿液體樣品2 mL加入2 mL無菌離心管中，2 500 r/min、4℃恒溫離心30 min，棄上清液保留沉淀；向離心管中加入1 mL無菌磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），輕輕混勻后轉移至1.5 mL離心管中，3 500 r/min室溫離心10 min，棄上清；向沉淀中分別加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩渦震蕩10 s混合均勻，100℃煮沸8 min，13 000 r/min離心3 min；將上清加入吸附柱中13 000 r/min離心1 min收集液體；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混勻，65℃水浴15 min（其間不斷輕柔地上下翻轉離心管），室溫放置5 min（其間不斷輕柔上下翻轉離心管）；4 000 r/min離心1 min，棄上清；向離心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min離心1 min，棄上清，重復2次；加入500 μL無水乙醇輕輕混勻，8 000 r/min離心1 min，棄上清；8 000 r/min離心30 s，用10 μL槍頭吸走殘余液體，室溫放置至徹底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬間離心，轉移上清液至新的離心管中-20℃保存備用。使用Nanodrop 核酸蛋白含量測定儀測定核酸濃度。
1.2.2引物及探針設計分別參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0設計牛奶、羊奶通用引物序列（UF、UR），大豆引物序列（Lectin-F、Lectin-R），內參引物序列（IACF、 IACR）。使用Beacon Designer 2.0 設計特異分子信標（MB）探針，其中牛奶探針（NP）用CY3標記，羊奶探針（YP）用JOE標記，豆漿探針（LectinP）用FAM標記，內標探針（IACP）用ROX標記，3′端的淬滅基團用Dabcyl修飾。引物及探針序列見表1。
1.2.3多重實時熒光定量PCR檢測體系建立通過優化反應體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立分別檢測羊、牛和大豆源性成分的單重熒光定量PCR體系。將4種引物及探針組合在一起，分別或同時以羊、牛和大豆基因組DNA為模板，優化引物、探針濃度和退火溫度等反應體系和條件，建立能同時檢測羊、牛和大豆源性成分的多重熒光定量PCR體系。
1.2.4結果判定實時熒光定量PCR擴增結束后獲取Ct值，當Ct值
1.2.5基因組DNA檢測靈敏度試驗分別提取羊奶、牛奶及豆漿的基因組DNA，用Nanodrop定量到50 ng/μL，做10倍梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4），對每個梯度按照優化后的擴增體系和條件分別進行檢測。
1.2.6羊奶中摻雜牛奶或豆漿靈敏度試驗將豆漿和羊奶以一定體積比例混合，制成豆漿含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品；將牛奶和羊奶以一定比例混合，制成牛奶含量分別為0、0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的混合奶樣品。按照優化后的反應體系和條件分別進行檢測。
1.2.7市售樣本檢測使用優化后的熒光定量PCR方法對35份奶制品樣本進行源性鑒定，驗證檢測方法的實用價值。
2結果與分析
2.1多重實時熒光定量PCR檢測體系的建立
參照優化的單重熒光定量PCR反應體系及條件，將羊、牛、大豆和內標質控的引物及探針組合在一起，先分別以羊、牛和大豆基因組DNA為模板優化反應體系，然后同時加入3種基因組DNA模板，通過調整反應體系中主要成分濃度和體積以及反應條件，優化反應體系，最終篩選出最適宜的多重實時熒光定量PCR體系。20 μL反應體系包括5× Premix 4 μL，HS-Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，引物 Mix（2 μmol/L）2 μL， 探針 Mix（2 μmol/L）2 μL，內標質控IAC DNA模板（1 ng/μL）2 μL，檢測樣品DNA 模板2 μL，雙蒸水7.8 μL。PCR反應條件為：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、34 s，40個循環，60℃延伸時收集熒光信號。圖1為多重實時熒光定量PCR擴增曲線圖，其中A圖同時檢測出羊和牛源性成分，大豆源性為陰性；B圖樣本中同時檢測出大豆和牛源性成分，羊源性成分為陰性。
2.2基因組DNA靈敏度試驗
結果（圖2）顯示，當模板DNA濃度稀釋至10-4倍，即DNA質量為0.01 ng時，所建立的熒光定量PCR檢測體系仍然能夠產生良好的特異擴增曲線。此時純羊奶、牛奶及豆漿模板檢測到的Ct值分別為33.64±0.02、34.80±0.018和34.87±0.03，均
2.3羊奶中摻雜牛奶或豆漿靈敏度試驗
將牛奶或豆漿以0.1%、0.5%、1%、5%、10%和20%的體積比摻入至純羊奶中，結果顯示當牛奶或豆漿含量為0.1%時，多重實時熒光定量PCR體系仍有特異性擴增曲線，并且其Ct值均
2.4市售樣本的實際檢測
利用本研究建立的羊奶中牛奶和大豆源性多重熒光定量PCR檢測體系對35份市售羊奶、羊奶粉、牛奶、牛奶粉進行源性鑒定。結果如表2所示，15份羊奶及相關制品中都含有羊源性成分，其中10份含有牛源性成分，4份含有大豆成分，分別占樣本總數的66%和26%；20份牛奶及相關制品中全部檢出牛源性成分，9份樣品中檢測出大豆成分，占樣本總數的45%。
3討論與結論
目前現有的牛羊乳檢測方法多是依據羊乳和牛乳化學組成上的差異，以牛羊乳中蛋白質、脂肪、DNA、維生素等為特征指標進行檢測[8]。色譜-質譜結合技術是分離蛋白質、定量檢測牛羊乳混摻的重要方法，有研究表明該方法可以實現牛羊乳混摻的快速檢測，能檢測牛羊混合乳中牛乳含量的最低水平為5%[9]。毛細管電泳-質譜聯用（CE-MS）技術也在牛羊乳檢測中得到了應用[10]，但存在檢測靈敏度偏低的缺點[11]。利用近紅外光譜法檢測摻假羊奶需要足夠的專業知識，建立模型才能對檢測結果進行分析，對檢測人員的要求較高，不易普及推廣[12]。熒光定量PCR方法是基于DNA水平的檢測，克服了以上技術的不足，被越來越多地應用到奶制品的檢測中。由于核酸比蛋白質更穩定，抗熱能力更強，并且含有更多遺傳信息，所以基于DNA的動物源性檢測方法比蛋白免疫法更有優勢[13]。
曾少靈等用多重實時熒光定量PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[14]；孟芳等應用熒光定量PCR方法僅能鑒別牛、羊奶[15]；劉小艷等用實時熒光定量PCR方法檢測模擬奶制品中常見谷物成分的檢出限為0.5%[16]。本研究參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高保守的16S rRNA基因和大豆的KTi-S基因為靶基因設計探針建立多重實時熒光定量PCR檢測方法，該方法不僅能夠針對羊奶、牛奶和豆漿進行快速準確的鑒別，而且能對奶制品進行摻假檢測；在擴增循環內只出現特異性擴增曲線無交叉擴增曲線；對純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng；對模擬摻假的奶制品中目標成分的最低檢出限為0.1%（V/V），說明本研究建立的多重實時熒光定量PCR方法具有特異性好、靈敏度高等優點。經實際市售奶制品檢測驗證了其可行性和適用性，適用于奶類樣品摻假的快速檢測。
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